bc 试管婴儿BCA蛋白浓度测定试剂盒完整版

2021年1月31日发(作者：潍坊试管婴儿吧)

BCA
蛋白浓度测定试剂盒

说明

2322 5
蛋白质化验试剂盒：为
500
试管或
5000
微孔板的检测提供充 足的试剂

23227
蛋白质化验试剂盒：为
250
试管或
2500
微孔板的检测提供充足的试剂

试剂盒组分：

BCA
试剂
A
，
1000 mL

(No. 23225
产品中
)
或

500mL

( No. 23227
产品中
)
，碳酸钠，

碳酸氢钠，二喹啉甲酸，酒石酸钠溶于
0.1 M
氢氧化钠中。




BCA
试剂
B , 25 mL,
包括
4%
硫酸铜

一次性标准白蛋白
, 2mg/ mL, 10

×



1 mL

安瓿
,
包含
2 mg/ mL
牛血清白蛋白
(BSA)

存
在于
0.9%
盐和
0.05%
叠氮化钠

中。

储存：以上试剂保持在室温下储存和装运

注意：
如果试剂

A
或

试剂

B
在低温下运输或长期储存时出 现沉淀现象，
可以通过缓慢加
温或轻轻搅拌溶液使沉淀物溶解。当试剂变色或确定微生物污染时 请丢球试剂盒。

目录

介绍
………………………………………………………………………………………
..1
准备标准试剂和工作试剂
………………………………………………………………
..2
准备试管
…………………………………………………………………………………
..3
准备微型版
………………………………………………………………………………..
3
故障检修
…………………………………………………………………………………
..4
有关美国热电其他产品
…………………………………………………………………
..5
附加信息
…………………………………………………………………………………
..5
参考文献
…………………………………………………………………………………
..6

介绍

美国热电（
Thermo
）公司的
BCA
蛋白浓度测定试剂盒

是基于二喹啉甲酸
(BCA)
通过比色检测和定量测定总蛋白的洗涤剂兼容配方。该方法通过碱性介质中的一种蛋白结合了
Cu2
使
其显著减少转变为

Cu1
（缩二脲反应）
。用一种含二奎琳甲酸 的试剂选择性的比色法高敏
感的比色杯中的
Cu1.

这种测定方法的紫色 色反应产物是通过
BCA
的两个分子和亚铜离子
螯合作用形成的。这种水溶性复合物在
562nm
处有强吸收峰。在大的活性范围内

(20-2000?
g / mL
）几乎同蛋白浓度增加呈线性关系。
BCA
法不是真正的终点的方法

；也就
是说，最终颜色继续发展。孵化之后
,
继续的颜色发展速度是足够慢以允许一起进行测定大
量样本。

大分子结构的 蛋白质
,
肽键的数量和存在的四个特定氨基酸
(
半胱氨酸
,
胱氨酸，
色氨酸和酪氨
酸
)
据说是与
BCA
形成颜色产物的 原因。因此
,
蛋白浓度的测量通常要参照标准的一个常见
的蛋白质如牛血清白蛋白。< br>一系列已知浓度的蛋白质稀释液是为与之相近的未知蛋白质浓度
测定准备的。
因为每一个 未知浓度的测定都需要基于标准曲线。
如果需要将一个未知蛋白精
确定量，
选择一个与 未知蛋白特性相似的标准蛋白是可取的。
例如，
当测定免疫球蛋白时牛
血清丙种球蛋白 可以被当做标准蛋白。以下给出了两种检测过程：




其中,
试管程序需要一个较大的体积
(0.1
毫升
)
的蛋白质样品。 然而
,
因为它使用了一个样
品比例为
1:20
的工作试剂
( v / v),
所以将干扰物质的影响降到最小。
在酶处理程序提供了一样
品处理酶， 需要体积较小
(10 -25?
L)
的蛋白质样品。然而
,
由于使用 了样品比例为
1:8
的工作
试剂
(v / v)
，所以在克服干扰物质浓度时灵活性降低，从而获得的检测水平较低。


1

标准试剂和工作试剂的准备（试验程序需要的两个）

A
．

准备稀释的
BSA
标准液

表1
为导向
,
准备一套蛋白质标准。
稀释标准的内容为
,
将一个盛在安瓿管中的标准
BSA
稀释
到几个洁净的瓶子中
,
最好使 用和样本
(s)
相同量的稀释剂。
根据表
1
的建议：
每1
毫升的

安
瓿管中加入
2
毫克
/
毫 升的
BSA
标准液对于准备一系列的标准稀释液是足够的。每个稀释标
准重复三次也是 足够量的。

表一：准备稀释的
BSA
标准液

标准试管协 议和微型版程序的稀释方案（活性范围
=20-2000
?
g/mL
）

管号

A
B
C
D
E
F
G
H
I
稀释液体积（
?L
）

BSA
来源及体积（
?L
）

0
125
325
175
325
325
325
400
400
300
的原液

375
的原液

325
的原液

175
的
B
管稀释液

325
的
C
管稀释液

325
的
E
管稀释液

325
的
F
管稀释液

100
的
G
管稀释液

0
BSA
终浓度
（
?L
/mL
）

2000
1500
1000
750
500
250
125
25
0=
空白

加强试管协议的稀释方案（活性范围
=5 -250
?
g/mL
）

管号

A
B
C
D
E
F
稀释液体积（
?L
）

BSA
来源及体积（
?L
）

700
400
450
400
400
400
100
的原液

400
的
A
管稀释液

300
的
B
管稀释液

400
的
C
管稀释液

100
的
D
管稀释液

0
BSA
终浓度
（
?L
/mL
）

250
125
50
25
5
0=
空白

B
：准备
BCA
的工作试剂（
WR
）

1.
总共需要的
WR
的体积可以通过以下公式计算出来：

（标准液
+
未知液）×（平行数目）×（每个样品中加入的
WR
体积）
=
总共所需的
WR
体
积

例如：标准的试管程序有三个未知液，每个样品做两组重复：

（标准液
9mL+
未知液
3 mL
）×（平行数目
2
）×（
2 mL
）
=
总共所需的
WR
体积
48mL
注意：试管程序中每个样品管加
2.0ml WR






微型版程序中每个样品中只需要加
200ul WR
2
、
WR
的制备：
（
BCA
试剂
A:B =50:1
）
，
对上述样品
,
将
50mL
试剂A
与
1mL
试剂
B
混合。

注意：当试剂B
加入到试剂
A
的开始，浊度观察表明：混合后迅速消失变成澄清的绿色的
2

ＷＲ。准备充足的
WR
是基于所测样品数量上的。如果将
W R
储存在处于室温（
RT
）的密
闭容器中，那么几天之内
WR
是稳定的。


简要步骤（试管程序，标准方案）

混合
WR
（
50A+1B
）

充分混合

（
0.1mL
样品
+WR
）

温
育
：
37
℃
,30min.
然后冷却

分光光度计

562nm
读吸光度


试管程序（样品：
WR =1:20
）

1
、
< br>用移液管移取每个标准品和所测样品的重复
0.1ml
到有标签的对应试管中。

2
、

在每个管中加
2.0ml
的
WR
，混匀。

3
、

封口，然后温育试管（选择时间和温度）

1
）标准方案：
37
℃

30min(working range=20-2000ug/ml)
2
）
RT
方案：
RT 2h(working range=20-2000ug/ml)
3
）
Enhanced Protocol(
加强方案
)
：
60
℃

30min(working range=5-250ug/ml)
注意：
每个实 验中都增加培育时间和温度，
增加５６２ｎｍ的净吸光度，
降低试剂的最低检
测水平和 方案的工作范围；

使用水浴加热管要么是标准
(37
°
C
培养
)
或是增强
(60
°
C
培养
)
协议 。
使用强制的培养可能
会因为热传递不均匀使其在颜色变化上引进明显的误差。

4
、

使所有管子冷却至室温

5
、
< br>分光光度计设定在
562nm
，当比色皿中装的是水时给仪器校零。随后，确保在
10min
内测完所有样品的吸光度。

注意：因为
BCA
测定不 是真正的终点，即使冷却到室温颜色还会继续变化。然而，由于在
室温下颜色变化速度比较慢，所以如果 在
10min
内测完所有试管的吸光度就不会引进明显
的误差。

6
、

所有的单个标准品与所测的样品重复在
562nm
测 得的吸光度都要减去在
562nm
测得
的所有空白标准品的吸光度平均值。


微型板程序（样品：
WR =1:8
）


1
、

用移液管移取
25ul
的
WR
到每 一个标准品与未知样品所在的微型板中（
working
range=20-2000ug/ml
）

3