试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
一、血清谷丙转氨酶（
SGPT
）赖氏改良法
器材:
试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、
721
型分光光度计、温度计、 动物血清
试剂
:
（
1
）
0.1mol/L pH7.4
磷酸盐缓冲液：
①
0.1mol/L
磷酸氢二钠溶液： 称取
Na2HPO414.22g
或
Na2HPO4·2H2O17.8g
溶
解于蒸馏水中，并稀释至
1 000ml,4
℃保存。
②
0.1mol/L
磷酸二氢钾溶液：称
KH2PO413.61g
溶解
dH2O
中，稀释至
1000ml,
4
℃保存。
③将
0.1mol/L
磷酸氢二钠溶 液
420ml
和
0.1mol/L
磷酸二氢钾溶液
80ml
混和即
为
0.1mol/L pH7.4
的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，
4
℃保存。
（
2
）
标准丙酮酸（含丙酮酸
2.0
μ
mol/mL
）
：
取标准丙酮酸钠
10mg
，用上述缓冲液准确定 容为
50mL
。此液须当日用当日配。
（
3
）
S GPT
底物液
(
含
α
-
酮戊二酸
2
μmol/ml
及
DL-
丙氨酸
200
μ
mol/ml) :
取
α
-
酮戊二酸
29.2mg
，
DL-
丙氨酸
7g
,
用试剂
1
溶成
100ml
，在稀释到刻度前，
以
1mol
/L
NaOH
调
pH 7.4
（因为转氨酶在
pH7.3
以下或
7.6
以上的环境中酶活性 下降）
，加数滴氯
仿防腐。此液于冰箱保存可使用
4
天。
（
4
）
GOT
底物液
(DL
–天冬氨酸
200mm ol/L
,
α
-
酮戊二酸
2mmol/L):
称取
α
-
酮戊二酸
29.2mg
和< br>DL-
门冬氨酸
2.66g
置于一小烧杯中
,
加入
1 mol/L
氢氧化钠
20.5ml
使溶解
,
并校正
pH至
7.4,
然后将溶液移入
100ml
容量瓶内
,
用< br>0.1mol/L
磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰
箱内保存。
（
5
）
2.4-
二硝基苯肼溶液
:
取分析纯
2,4-
二硝基苯肼
19.8mg
，用
1mol/L HCl
溶于
100ml
，置棕色瓶中保存。
（
6
）
0.4mol/L NaOH
溶液
:
称取
16g
固体
NaOH
，用蒸馏水溶解，冷却至室温，定容至
1000 mL
，备用。
操作步骤：
1
、标准曲线绘制：取试管
18
支按下表操作。
试
管
号
对
照
丙酮酸标准液（
1
毫升
2
微克分子）
0
SGPT
或
SGOT
底物
0.50
1
2
3
4
5
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.1M
磷酸盐缓冲液
PH7.4
相当于谷丙转氨酶单位
相当于谷草转氨酶单位
0.1
0
0
0.1
28
24
0.1
57
61
0.1
97
114
0.1
150
190
0.1
200
—
每个样做
3
个平行，置
37
水浴
30
分钟，各管加
2
，
4-
二硝基苯肼液
0.5mL
， 混匀，再在
37
℃水浴中放置
20mL
，各管加
0.4mol/L< br>氢氧化钠溶液
5mL
，混匀，
10
分钟后，从水浴箱中
取出， 以蒸馏水调“零”点，用
520nm
波长比色，读取各管之吸光值，各管之吸光值均减去
空白的吸光值，然后以吸光值为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标。绘制成标准曲线。
为了方便 ，可列出各光度相当于转氨酶单位表。
2
、酶活性测定：取试管两支，注明测定管及对照管。
试剂
样品测定（每个样
3
个平行）
对
照（每个样
3
个平行）
血
清（
mL
）
0.1
0.1
SGPT
或
SGOT
底物（
mL
）
0.5
—
置
37
℃水浴
30
分钟（< br>SGOT
为
37
℃，
60
分钟后再加枸橼酸苯胺
1< br>滴）
2.4-
二硝基苯肼（
mL
）
0.5
0.5
置
37
℃水浴
20
分钟
SGPT
或
SGOT
底物（
mL
）
—
0.5
NaOH
溶液（
mL
）
5.0
5.0
对照及样品各做
3
个平行，充分摇匀，静置
10
分钟后，用
520nm
波长比色，以蒸馏水调
节零点，读取吸光值，用 样品减去对照吸光值，求得样品的谷丙转氨酶活力。
?
谷丙转氨酶活性单位：
37
℃，
pH7.4
，
每小时每毫升血清催化生成
1
μ
mol
丙 酮酸为
1
个单位。
例：
0.1ml
血清每小时催化生成
0. 1
μ
mol
丙酮酸
,
即相当于
GPT 100U / 100ml
血清。
?
注意：
1.
在测定
SGPT
时，应事先将底物、血清在
37
℃水浴中
保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。
2.
标准曲线上数值在
20~500U
是准确可靠的，超过
500U
时，需将样品稀释。
3.
转氨酶只能作用于
α
－
L
－氨基酸，对
D
－氨基酸无
作用。实 验室多用
α
－
DL
－氨基酸（较
L
－氨基酸
价廉）
，若用
L
－氨基酸，则用量减半。
4.
溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，
会影响测定效果。
5.
血清样品的测定需在显色后
30
分钟内完成。
6.
丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易
变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不
易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。
7.
每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过
0.015A
，若有
超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.
严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本
可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管
优点：尽管基质 液中余下的
a-
酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果
,
但因其量不多
,
加之对
505nm
的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合 物强
,
尤其用标准曲
线作测定时
,
所用的酶活性单位通过卡门氏分光 光度速率法矫正
,
摈弃了赖氏法一些固有弊端
,
结果比其他比色法准确
.
故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏
法
.1981< br>年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定
ALT
活性较为合理
, < br>缺点：由
于赖氏法设计的底物浓度
,
如
a-
酮戊二酸不足,
反应速度只能达到最大速度的
65%;
显色剂
2,4-
二硝基 苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半
;
保温
30min
的酶促反应后,
新生成的丙酮酸
和未用完的
a-
酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显 色的几率问题
,
如此等等
,
使赖氏法的重
现性较差
,
在测量精度上仍与连续监测法相差甚大
.
* 1
个卡门氏单位的定义是 ：在温度
25
℃，
pH7.4
，波长
340nm
，光径1cm
的条件下，
1ml
血清使
NADH
的吸光 度下降
0.001
的转氨酶活性。
*
国际单位：在最适温度（< br>25
℃）下，
1
分钟产生
1
μ
mol
丙酮酸 的酶量为
1
个活性单位，即
1IU=1umol/min
。
* King
法单位定义是：每
1ml
血清在
37
℃条件下 与底物作用
60 min
，生
成
1
μ
mol
丙酮酸称为一个单位。
* Mohun
法单位定义是：每毫升血清在
pH=7.4
，
37
℃条 件下与底物作用
30 min
，每生成
2.5
微克丙酮酸为
1
单位。
二、
尿素氮（< br>BUN
）
（
二乙酰一肟法尿素测定
）
（一）仪器设备：水浴锅、紫外分光光度计、
10mL
试管
（二）
试剂：
1
、尿素氮试剂：
蒸馏水
100m L
，
浓硫酸
44mL
，
85%
磷酸
66mL
，
冷却至室温后，
加氨基硫脲
50mg
，
硫酸镉
（
3CdSO4
·
8H2O
）
2g
，溶解后稀释至
1000 mL
。
2
、
20g/L
二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟
20g
，加入蒸馏水溶解，定容至
1000mL
。
3、
尿素氮标准贮存液（
357mmol/L
）
：称取尿素
1.0 72g
溶解于蒸馏水中定容至
1000mL
，至于棕色瓶中贮存。
4
、
尿素氮标准应用液
（
17.85mmol/L
）
：取贮存液
5mL
，
加蒸馏水定容至
100mL
。
（三）操作步骤
按下面表格的试剂配比操作：
试剂
血清（
ml
）
尿素氮标应用准液
（
ml
）
蒸馏水（
ml
）
二乙酰
-
肟试剂（
ml
）
尿素氮试剂（
ml
）
测定管
0.02
-
0.5
5.0
标准管
-
0.02
0.5
5.0
空白管
-
-
0.02
0.5
5.0
按上述表的配方每个样做
3
个平行样，混匀，置沸水浴中加热
15min
，立即
用自来水冷却
5
分钟。分光光度计选用
540nm
波长，以空白管调零点，读取各
管吸光度 。
尿素（
mg%
）
=
测定管吸光度
/
标 准管吸光度×
17.85(mg/ml)
?
1.
此法灵敏度高，用量极微（一般只需
0.02ml
血清即可）
。本实验是先将血清用生理
水以
1
：
4
加以稀 释再取
0.1ml
，故最后计算时，应乘以稀释倍数“
5
”
?
2.
试剂中加入硫胺脲和镉离子，
可增进显色强度和色泽稳定 性，
但仍有轻度褪色现象
（小于
5%/h
）
。
?
3.
此法操作简单，特异性强，不受其他非蛋白质含氮化合物如尿酸、 肌酸等影响，但
应控制好实验条件。
?
4.
吸管必须校正，使用时务必注意清洁干净，加量务必准确。
?
5 .
尿液中的尿素氮也可用此法进行测定。由于尿液中尿素氮含量高，标本需用蒸馏水
以
1:50
稀释。如果呈色后吸光度仍超过本法的线性范围，还需将尿液再稀释，重新测
定。
?
3
．尿素浓度以前习惯用尿素氮表示，尿素分子中含有二个氮原子 ，因此
1mmol/L
尿
素等于
2 mmol/L
尿素氮。世界卫生 组织推荐使用尿素，并以
mmol/L
表示浓度单位，
我国卫生部也已规定一律使用尿 素，不再使用尿素氮一词。
?
尿素氮
mg% =
测定管
/
标准管×
0.002
×
100/0.1
×
5
=
测定管
/
标准管×
10
【参考范围】
5-20 mg/dl
三、
肌酐（
Cr
）
四、血糖（
Glu
）
（邻甲苯胺法）
血糖是指血液中的葡萄糖，葡萄糖与冰醋酸、邻甲苯胺共热时，葡萄糖先
脱水转化为羟甲基糠醛，再与邻甲苯胺缩合为蓝绿色的薛夫碱，其颜色的深浅
与葡萄糖含量成正比。可用 比色法进行定量测定。
1
、仪器：紫外分光光度计、水浴锅
2
、试剂：
（
1
）
葡萄糖标准母液
（
10mg/ml
，用饱和苯甲酸溶液配制）
（
2
）邻甲苯胺溶液：
2.5g
硫脲溶于冰醋酸， 加入邻甲苯胺
150ml
及
2.4%
硼酸
100ml
，用冰 醋酸
定容至
1
升。
3
、操作步骤：
（
1
）配置不同浓度葡萄糖标准溶液：取
5
支
10ml
容量瓶 ，标号，依次加入葡
萄糖母液
0.25
，
0.5
，
1.0< br>，
2.0
，
3.0ml
，用饱和苯甲酸稀释至
10ml
，混匀
（则上述溶液
100ml
葡萄糖含量为
25
，
50
，
100
，
200
，
300mg
）
；
（
2
）分别精密吸取不同浓度葡萄糖标准溶液于试管 中，设平行管，空白管加
0.1mL
蒸馏水，各管加入邻甲苯胺试剂
5.0mL
，混匀后，置沸水中
15
分
钟，立即移入冷水浴中冷却；
（
3
）以空白号管调零，于紫外分光光度计波长
630nm
处测吸 光值，以各管的
吸光度为纵坐标，
相应管中葡萄糖含量（
mg
）为横坐标，绘 制标准曲线，
得出线性方程。
（
4
）测试样品：取全血
0 .1mL
，设平行样，按上述方法测出其
A
630nm
吸光值，
通过 线性方程求出其血糖含量。
试剂（
mL
）
邻甲苯胺试剂
不同浓度葡萄糖标准溶
液
0
5.0
0
1
5.0
0.1
2
5.0
0.1
3
5.0
0.1
4
5.0
0.1
5
5.0
0.1
蒸馏水
100mL
全血相当于葡萄
糖质量
mg
A
630nm
0.1
0
0.000
0
25
0
50
0
100
0
200
0
300
注意事项：
1.
本法不需要除去蛋白质，
邻甲苯胺试 剂只与醛糖显色，
血液中其他还原性物
质基本上无影响。
2.
邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、
冰醋
酸浓度、加 热时间有关。此法显色稳定，
24
小时内无变化。如将加热时间缩短，
生成颜色容易消 褪。
3.
轻度溶血的血清对结果无明显影响。根据推导，血清中含血红蛋白
450
毫
克
/100
毫升时，可使测定结果降低约
10%
。
4.
高脂血的标本最后显色有时会出现浑浊，影响测定结果。可先制备血滤液后再行测定。
五、血清白蛋白（
Alb
）
（溴甲酚绿法
BCG
）
原理：血清白蛋白在
PH4.2
的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活 性剂存
在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（
BCG
）结合形成蓝绿色复合物，在波长
630
纳米处有光吸收峰，
其颜色的深浅与白蛋白浓度成正比，
与同样处理的 白蛋
白标准比较，可求得血清白蛋白含量。
试剂：
1.
溴甲酚绿（
BCG
）贮存液：取
BCG
419mg
，用
10ml
0.1mol/L
NaOH
溶解，
加
NaN3 100mg
，
定容至
1000mL
。
贮于棕色瓶备用。
如用溴甲酚绿钠盐应称取
432mg.
加水溶解。
2. 0.1mol/L
柠檬酸缓冲液
（
pH 4.2
）
：
分别配 制
0.1mol/L
柠檬酸和柠檬酸钠溶液，
然后按
12.3
：7.7
的体积比例混合。每
1000ml
混合液加入
NaN
3< br> 100mg
。
3. 30%
聚氧化乙烯月桂醚
(Brij-35)
溶液：取
Brij-35 30 g
，加少量水，
60
℃水浴溶
解，加水至
100ml
（此可 用
Tween-20
或
Tween-80
代替
)
。
4.
BCG
应用液：
BCG
贮存液
250ml
，
0.1mol/L
柠檬酸缓冲液（
pH4.2)750ml
，
30% Brij-35 8ml(
也可以用
Tween-20 8ml
或
Tween-80 10ml
代替）混合而成。
5.标准蛋白溶液（
10mg/ml)
：称取白蛋白
1.00g
，用生理盐水 。
实验操作：
1.
白蛋白标准曲线绘制
(1)
稀释白蛋白标准液：
分别精密量取白蛋白标准液
0.10 mL
，
0.20 mL
，
0.40 mL
，
0.60 mL
于试管中，再在每个管中依次加入蒸馏水
0.9 mL
，
0.8 mL
，
0.6 mL
，
0.4 mL
，混匀，得到稀释后白蛋白标准液含量分别为
1.0 mg/ml
，
2.0 mg/ml
，
4.0 mg/ml
，
6.0 mg/ml
。
(2)
分别精密量 取每个不同浓度稀释白蛋白标准液
0.2mL
于试管中，
空白管加入
生理盐水
0.2mL
，设平行样，再在每个管中加入
BCG
应用液
5.0mL
，混匀后
以空白管调零，立即于紫外分光光度计测吸光值，吸收波长为
620mn，绘制
标准曲线，得出线性方程。
(3)
样品血清白蛋白测定：用生 理盐水按
1
：
10
的比例稀释血清，取稀释后的血
清
0.2 ml
按上述方法测出其吸光值，求得其白蛋白含量。
注意事项
?
1
．
BCG
是一种
PH
指 示剂，
变色域为
PH3.8
（显黄色）
～
5.4
（显蓝绿色 ）
，
因此控制反应液的
PH
是本法测定的关键。
?
2
．配制
BCG
试剂也可用其他缓冲液如枸椽酸盐或乳 酸盐缓冲液。但以琥
珀酸缓冲液的校正曲线通过原点，线性好，灵敏度高，成为首选推荐配方。
?
3
．试剂中的
Brij-35
也可用其他表面活性剂代 替，如吐温
20
或吐温
80
，
终浓度为
2ml
，灵 敏度和线性范围不变。
?
4
．当白蛋白标准与
BCG< br>结合后，溶液光径
1
，在
630
处测定的吸光度应
为
0.811
±
0.035
，如达不到此值，表示灵敏度较差。
?
5
．
蛋白质标准液是一个复杂的问题，
实验证明，BCG
不但与白蛋白呈色，
而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以球蛋白、运铁蛋白、 结合珠蛋白
更为显著，
其反应速度较白蛋白稍慢。
由于
30S
内呈色 对白蛋白特异，
故
BCG
与血清混合后，在
30S
内读取吸光度，可 明显减少非特异性呈色反应。为了
减少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。
?
1
．本法操作简便、快速、胆红素、溶血和中度脂血无干扰，既可手工操
作，也能自动化分析，是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。
?
2
．本法线性范围
10-60g/L
，
RCV
＜
4%< br>。但该法与溴甲酚紫法比较，对血
清白蛋白特异性稍差。
六、血清总蛋白（
TP
）
（双缩脲法）
原理：
血清中蛋白质分子的肽键与双缩脲试剂中的
Cu++
结合形成紫色化 合物；
其色度与总蛋白的浓度成正比，在
546
波长下进行比色测定。实际上凡是分子内含有两个氨基甲酰基（
-CONH2
）的化合物，不论直接相连或是通过
一 个氮或碳原子间接连接，均能与双缩脲试剂发生反应。蛋白质分子内含
有许多肽键（
-CONH 2
）
，因此可用双缩脲法作比色测定。但应注意的是不
仅仅是（
-CONH 2
）
，凡含
-CSNH2
、
-C
（
NH
）
NH2
或
-CH2NH2
等基团而
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
试管降调期间-试管婴儿地区孕酮片吃多久
本文更新与2021-01-31 16:33，由作者提供，不代表本网站立场，转载请注明出处：http://www.xapfxb.com/yuer/438794.html
-
上一篇：第三代试管婴儿能够解决遗传病问题吗
下一篇：动物标本制作论文