熊安食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定

2021年1月30日发(作者：御宅男)

食品安全国家标准

食品中烟酸和烟酰胺的测定

1

范围

本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。

本标准第一法为微生物法，
适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和
烟酰胺总量的测定；
第二法为高效液相色谱法，
适用于含量较高或强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。

第一法

微生物法

2

原理

烟酸是植物乳杆菌
Lactobacillμs plantarμm
（
A
TCC 8014
）
生长所必需的营养素，
在一定
控制条件下，将植物乳杆菌液接种至添加试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率 ，
根据烟酸含量与透光率的标准曲线计算出试样中烟酸的含量。

3

试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为
GB/T
6682
规定的二级水。培养基可购买符合测试
要求的商品化培养基。

3.1

试剂

3.1.1

盐酸（
HCl
）。

3.1.2

氢氧化钠（
NaOH
）。

3.1.3

氯化钠（
NaCl
）。

3.1.4

浓硫酸（
H
2
SO
4
）。

3.1.5

溴麝香草酚蓝（
C
27
H
28
Br2O
5
S
）：
pH
指示剂。

3.1.6

乙醇（
C
2
H
5
OH
）。

3.2

试剂配制

3.2.1

盐酸溶液（
1 mol/L
）：用量筒量取吸取
83 mL
盐酸，于
1000 mL
烧杯中，加
917mL
水，混匀。

3.2.2

盐酸溶液（
0.1 mol/L
）：吸取
3.2.1
盐酸溶液
10mL
，加水溶解至
100mL
。

3.2.3

氢氧化钠溶液（
1 mol/L
）：称取
40 g
氢氧化钠于
1000 mL
烧杯中，加水溶解并稀释
至
1000 mL
，混匀。

3.2.4

氢氧化钠溶液（
0.1 mo l/L
）：吸取
3.2.3
氢氧化钠溶液
10mL
，加水溶解至100mL
。

3.2.5

生理盐水（
0.9%）：称取
9g
氯化钠（
NaCl
），溶解于
1000ml
水中，分装
10mL
于
试管中，
121
℃灭菌
15min
，备用。

3.2.6

乙醇溶液（
25%
）：量取
200 mL
无水乙醇与
800 mL
水混匀。

1


3.2.7

硫酸溶液（
1 mol/L
）：于
2000mL
烧杯中先注入
700mL
水，用量筒量取
56mL
硫酸
沿烧杯壁缓慢倒入水中，用水稀释 到
1000mL
。

3.3

培养基

3.3.1

乳酸杆菌琼脂培养基：称取光解胨
15g
，葡萄糖10g
，磷酸氢二钾
2g
，聚山梨糖单油
酸酯
1g
，琼 脂
10g
于
1000 mL
烧杯中，加入番茄汁
100mL
，加
900mL
蒸馏水溶解，混匀，
调
pH6.8±
0.2
（
25
℃），分装
10mL
于试管中，
121
℃高压灭菌< br>15min
，备用。

3.3.2

乳酸杆菌肉汤培养基：称 取光解胨
15g
，葡萄糖
10g
，磷酸氢二钾
2g
，聚山梨 糖单油
酸酯
1g
，
于
1000 mL
烧杯中，
加入 番茄汁
100mL
，
加
900mL
蒸馏水溶解，
混匀，调
pH6.8±
0.2
（
25
℃），分装
10mL于试管中，
121
℃高压灭菌
15min
，备用。

3.3.3

烟酸测定用培养基：维生素测定用酪蛋白氨基酸
12g
，葡萄糖
40g
，乙酸钠
20g
，
L-
胱氨酸
0. 4g
，
DL-
色氨酸
0.2g
，盐酸腺嘌呤
20mg
，盐酸鸟嘌呤
20mg
，尿嘧啶
20mg
，盐酸
硫胺素
2 00
?
g
，泛酸钙
200
?
g
，盐酸吡哆醇
400
?
g
，核黄素
400
?
g
，
p-
氨基苯甲酸
100
?
g
，生
物素
0.8
?
g
，磷酸氢二钾
1g
，磷酸二氢钾
1g
，硫酸镁
0 .4g
，氯化钠
20mg
，硫酸亚铁
20mg
，
硫酸锰20mg
。加蒸馏水至
1000mL
，用
0.1 mol/L
氢 氧化钠溶液（
3.2.4
）调
pH
至
6.7±
0.2
（
20
℃
~25
℃）。
注：自行配制烟酸测定培养基时，所有试剂 不得含有烟酸。

3.4

标准品

3.4.1

（
C
19
H
19
N
7
O
6
）：纯度≥
99 .5%
。

3.5

标准溶液的配制

3.5.1

烟酸标准储备液（
0.1mg/mL
）：精确称取
50.0 mg
烟酸标准品，用乙醇溶液（
3.2.5
）
溶解并移至
500 m L
容量瓶中，定容，混匀于
2
℃
～
4
℃冷藏。此溶液每mL
相当于
100
?
g
烟
酸。

3.5.2

烟酸标准中间液
（
10
?
g/mL< br>）
：
准确吸取
10.0mL
烟酸标准储备液
（
3.5.1
）
置于
100 mL
棕色容量瓶中，用乙醇溶液（
3.2.5
）稀释并定容至刻度，混匀于
2
℃< br>～
4
℃冷藏。此溶液每
mL
相当于
10
?
g
烟酸。

3.5.3

烟酸标准中间液（
1
?
g/mL
）：准确吸取
1.0mL
烟酸标准储备液（
3.5.1
）置于
100 mL
棕色容量瓶中，用 乙醇溶液（
3.2.5
）稀释并定容至刻度，混匀于
2
℃
～
4
℃冷藏。此溶液每
mL
相当于
1
?
g
烟酸。
3.5.4

烟酸标准工作液
（
100ng/mL
）
：
准确吸取
5.00 mL
烟酸标准中间液
（
3.2.2
）
置于
50 mL
容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀于
2
℃
～
4
℃冷藏。此溶液 每
mL
相当于
100ng
烟酸。

3.5.5
< br>烟酸标准工作液
（
40ng/mL
）
：
准确吸取
0. 4mL
烟酸标准中间液
（
3.5.2
）
置于
100 mL
棕色容量瓶中，用乙醇溶液（
3.2.5
）稀释并定容至刻度，混匀于
2℃
～
4
℃冷藏。此溶液每
mL
相当于
40ng
烟酸。

4

仪器和设备

4.1

天平：感量分别为
0.1g
和
0.1 mg
。

4.2

均质设备：用于试样的均质化。

4.3

恒温培养箱：
36
℃
±
1
℃。

2


4.4

漩涡振荡器。

4.5

压力蒸汽消毒器：
121
℃
(0.10 mPa
～
0.12 mPa)
。

4.6

离心机：转速
≥2000 rpm
。

4.7

pH
计：精度
±
0.01
。

4.8


分光光度计。

4.9

超净工作台。

4.10

超声波振荡器。

4.11

微孔板酶标仪

5

菌种的制备与保存

5.1

菌种：植物乳杆菌
Lactobacillμs plantarμm
（
ATCC

8014
）。

5.2

储备菌种的制备


将
菌种植物乳杆菌
Lactobacillμs plantarμm
（
ATCC 8014
）
转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，
在
36
℃
±
1
℃恒温培养箱中培养
20
h
～
24
h
，取出后放入
2
℃～
4℃冰箱中保存。每月至少传
种一次，作为储备菌株保存。

实验前将储备菌株接种 至乳酸杆菌琼脂培养基中，
在
36
℃
±
1
℃恒温培养箱中培 养
20 h
～
24 h
以活化菌株，
用于接种液的制备。
保 存数周以上的储备菌种，
不能立即用作接种液制备，
实验前宜连续传种
2~3
代以保证菌株活力。


5.3

接种液的制备


试验前一天，
从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的
10mL
乳酸杆菌肉汤培养基
（
3.3.2
）中，于
36
℃
±1
℃恒温培养箱中培养
6 ~18h
。在无菌条件下离心该培养液
15m in
，
倾去上清液。加入
10mL
已灭菌的生理盐水（
3.1.3< br>）重新分散细胞，于旋涡混合器上快速混
合均匀，离心
15min
，倾去上清液 。重复离心和清洗步骤三次。以第三次细胞分散液中吸取
1mL
加入
10mL
已灭菌的生理盐水（
3.1.3
）
，使其充分混合均匀制成混悬液，备用。用
721
分光光度计，
在
550nm
波长下，
以
0.9
％生理盐水为参比，
读取该菌悬液的浊度值透光值
（％
T
）
，用< br>0.9
％生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值，使其范围在
60~80
％之 间。立即使
用。

6

试管法

所有操作均需避光进行。

6.1


试样制备

3


谷薯类、豆类、坚果（去壳）等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径
0.3 mm
～
0.5 mm)
；
乳粉、米粉等试样混均；肉、蛋、鱼、动物内脏等用 打碎机制成食糜；果蔬、半固体食品等
试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。
4
℃ 冰箱保存，
1
周内测定。

6.2

试样提取
< br>准确称取约含烟酸
0.1mg
的试样，
一般乳类、
新鲜果蔬试样
2 g
～
5 g
（精确至
0.0001g
）
；
谷 类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样
0.2 g
～
1 g
（精确至0.0001g
）
，液态试样
5g
；
乳粉、米粉等准确称取适量 试样
2 g
（精确至
0.0001g
）
；一般营养素补充剂、复合营 养强化
剂
0.1 g~0.5 g
；
食品
0.2 g~1 g
；
液体饮料或流质、
半流质试样
5 g~10 g
于
100 mL
锥形瓶中，
加入硫酸溶液（
3.2.6
）
，加入被检验物质干重
10
倍的硫酸溶液（
3.2.6
）
。 在
121
℃下，水解
30min
后冷却至室温。用
0.1 mol/ L
氢氧化钠溶液（
3.2.4
）调
pH
至
6.0~6.5< br>，再用
0.1 mol/L
盐酸调
pH
至
4.5±
0 .1(3.2.2)
，用水定容至
100mL
，用无灰滤纸过滤，滤液备用。

6.3

稀释

根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释
(
f
)
，
使稀释后试样提取液中烟酸含
量在
50. 0 ng ~500.0 ng
范围内。

6.4

测定系列管制备

6.4.1

标准系列管

取试管分别加入烟酸标准工作液
0.00 mL
、
0.5 mL
、
1.0 mL
、
1.5mL
、
2.0 mL
、
2.5 mL
、
3.0 mL
、
4.0 mL
和
5.00mL
，
补水至
5.0 mL
，
相当于标准系列管中烟酸含量为
0. 0 ng
、
50 ng
、
100 ng
、
150ng
、
200ng
、
250ng
、
300ng
、
400 ng
、
500 ng
。加
5.0 mL
烟酸测定用培养基，见
表
1
。混匀。 每个标准点应制备
3
管。

表
1
标准曲线管的制作

试管号
(No.)
蒸馏水
(mL)

标准溶液
*(mL)
培养基
(mL)
1
5
0
5
2
5
0
5
3
4.5
0.5
5
4
4
1
5
5
3.5
1.5
5
6
3
2
5
7
2.5
2.5
5
8
2
3
5
9
1
4
5
10
0
5
5
*
试管

No.1
－
2
中不添加标准溶液；
2
中滴加菌液；



No.3
－
10
中添加标准品溶液的浓度依次增高 。
3
个重复。

6.4.2

试样系列管

取
4
支试管，分别加入
1.0 mL
、
2.0 mL
、
3.0 mL
、
4.0 mL
试样提取液，补水至
5.0 mL
，
加入
5.0 mL
烟酸测定用培养液，见表
2
。混匀，每个浓度做
3
个重复。







4