眼病乳酸菌的培养检测方案

2021年1月30日发(作者：痔疮怎么办)
品质管理检测项目


细菌形态学分类



一


乳酸杆菌

乳酸杆菌的基本属性：

乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，
并生成大量乳酸的一类细菌的总称。
利用
发酵技术保藏食品，
最典型的是通过乳酸菌的发酵。
这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。
利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，
已经生产出多种不同类型的发酵乳。
因而分离和鉴 定乳
酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。

无芽孢，革兰氏染色呈阳性。 微好氧，厌氧发酵，最适温度
30~40
摄氏度，最适
PH
值
为5.5~6.2
，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为
5%~10%
的
C O
2
可以增加
其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。

（一）实验仪器和试剂：

实验仪器：

现有的仪器：

欠缺的仪器：


培养基和试剂：

①

培养基：
BCP
培养基、
MRS
培养基和
SL
培养基

BCP
培养基：酵母膏
2 5g
，蛋白胨
5g
，葡萄糖
5g
，溴甲酚紫
0.04g
，琼脂
15g
，蒸馏水
lO00ml
，
pH7 0
；

MRS
培养基
（可 以培养包括双岐乳杆菌、
嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）
：
重

量
(g)
牛肉蛋
白粉

10
，鱼肉汁

10
，酵母浸出汁粉

5
，葡萄糖

20
，醋酸钠

5
，柠檬酸二铵

2
，吐
温
80 0.1
，硫酸镁

0.58
，硫酸锰

0.28
，蒸溜水

1 000ml
，备注：用高压锅在
121
℃灭菌
15min
，调节
pH6.2< br>～
6.4
。

乳酸杆菌选择性琼脂
SL
：酪蛋白水解物

10g
；酵母提取物

5g
；柠檬酸二铵

2g< br>；乙酸
钠
（
CH3COONa
？
3H2O
）

25g
；
MgSO4
？
7H2O 0.58g
；
琼脂

15g
；
葡萄糖

20g
；
吐温
80 1.0ml
；
磷酸氢二钾

6g
；
FeSO4
？
7H2O 0.03g
；
MnSO4
？
4H2O 0.15g
。
以上用 量为
1000ml
培养基的
用量。溶解琼脂在
500ml
的沸水中， 溶解其他组分在
500ml
的水中，用冰醋酸调
pH=5.4
，
并混 合已融化的琼脂，
进一步煮沸
5
分钟，
倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭 菌的试管，
这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。


乳酸杆菌在液体培养基中的生长状况



背景资料：

培养基有
MRS
培养基、

RS MA
培养基、番茄汁琼脂
培养基。当乳酸杆菌是待分离区
系的优势菌时，
常用
MRS
培养基对其进行分离。
一些常见的食品污染菌如金黄色葡萄球菌、
大肠杆菌等在
MRS
培养基上生长较差或几乎不生长，从而减少了杂菌的污染，降低了分离
难度。目前
MR S
培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基。常用于从
乳酸杆菌发酵制品中 分离
菌种
以及菌种分离后的传代培养。







番茄汁
琼脂
培养基，
这是一种传统的用于分离乳酸杆菌 的培养基，
此种培养基由于含有
一定量的番茄汁，
为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，
使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。
但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较 为费时费力，目前已逐渐被

MRS
等培养基所代替。


某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质

(
例如肠道
)
内进行乳酸杆菌的分离。
APT(
All

Purpose

Tween)
培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的
Rogosa

SL(
Rogosa

Sodium

Lactate

Modified
)
完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸
杆

菌的分离。
Briggs
琼脂培养基和
s L( Sodium Lactate)
培养基常用于酸奶中乳酸杆菌分离。

（二）检测内容、流程、方式：

内容：
1
通过对水体当中的的乳 酸杆菌的筛选培养，
最后计数得到相应水体当中的乳酸
杆菌的数量。方法为：逐级稀释法。2

乳酸杆菌的定性

流程：

①采集：每个采集点 各自采集
10ml
的池塘水，经过过滤杂质（固体）
，冷冻运送等环
节送到实 验室内部。

②稀释平板测数法

1
、样品稀释液的制备

准确称取待测样品
10g
，
放入装有
90mL
无菌水并放有 小玻璃珠的
250mL
三角瓶中，
用
－
1
手或置摇床上振荡
20min
，使微生物细胞分散，静置
20
～
30s
，即成
10
稀释液；再用
1mL
－
无菌吸管，吸取
10
1
稀释液
1mL
，移入装有
9mL
无菌水的试管中，吹吸
3< br>次，让菌液混合
－
－
均匀，即成
10
2
稀释液；再换 一支无菌吸管，吸取
10
2
稀释液
1mL
，移入装有
9mL
无菌
－
－
－
－
水的试管中，也吹吸
3
次， 即成
10
3
稀释液；以此类推，连续稀释，制成
10
4
、< br>10
5
、
10
－
－
－
6
、
10
7
、
10
8
、
10
9
等一系列稀释菌 液。

用稀释平板计数时，
待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含 待测菌的数量多
－
－
－
时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数 时，采用
10
7
、
10
8
、
10
9
稀释度，
－
－
－
－
－
测定土壤细菌数量时，采用
10
4
、
10
5
、
10
6
稀释度，测定放 线菌数量时，采用
10
3
、
10
4
、
10
5
稀释度，测定真菌数量时，采用
10
2
、
10
3
、
10
4
稀释度。

2
、平板接种培养



平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。

⑴混合平板培养法

－
－
－
将无菌平板编上
10< br>7
、
10
8
、
10
9
号码，每一号码设置三 个重复，用无菌吸管按无菌
－
－
－
操作要求吸取
1×
10< br>9
稀释液各
1mL
放入编号
10
9
的
3个平板中，同法吸取
10
8
稀释液各
－
－
－
1 mL
放入编号
1×
10
8
的
3
个平板中，再吸取< br>1×
10
7
稀释液各
1mL
放入编号
1×
1 0
7
的
3
个
平板中，
由低浓度向高浓度时，
吸管可 不必更换。
然后在
9
个平板中分别倒入已熔化并冷却
至
45
～
50
℃的细菌培养基，
轻轻转动平板，
使菌液与培养基混合均匀，
冷凝后倒置，
在
30
℃
下培养。至菌落长出后即可计数。

⑵涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后 趁热倒入无菌平板
中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取
0.1mL
菌液对号接种在 不同稀释度编号的琼脂平
板上，
每个编号设三个重复。
再用无菌刮铲将菌液在平板上涂 抹均匀，
每个稀释度用一个灭
菌刮铲，
更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。
在由 低浓度向高浓度涂抹时，
也可以不更换刮铲。
将涂抹好的平板平放于桌上
20
～
30min
，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培
养，至菌落长出后即 可计数。

－
－
－
－

⑶划线法（不采用，因为需要对乳酸菌和大肠杆菌进行筛选培养）
：

用灭菌 接种环沾取
10-1
稀释液
1
环于已凝固的平板上进行划线
（图示）
。
划线可按以下
两种方式进行，
一种为交叉划线法，
是在平板的一边 做第一次
“Z”
字形划线。
转动培养皿
70°
角，将接种环在火上烧 过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次
“Z”
字形划线。同法进
行第三次、第四次划线。
另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，
连续作紧密的波
浪 式划线，直至平板中央。转动培养皿
180°
，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。
划线法实质上属于一种
“
由点到线
”
的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯
化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。

以上各种分离法，都应按无菌操作进行。所用的培养基若在倒平板前，按
50?
g/m L
的
量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用）
，效果会更好。





3
、培养（
16
个小时即可）