小便黄是怎么回事木瓜蛋白酶

2021年1月30日发(作者：怎么治疗荨麻疹)
木瓜蛋白酶的固定及其作用

摘要：木瓜蛋白酶
[ EC 3. 4. 22. 2 ]
是一种重要的生化产品，在食品、医药工业中有广泛的用途
,
还用
于饲料、纺织及制革等领域
[ 1 ]

。

由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用
,
促使人们研究和制备固定
[
2
]
化木瓜蛋白酶。此研究始于
20
世纪
60
年代初
,
至今已有许多文献报道
法、吸附法、共价键结合法、交联法等
,
这些方法各有利弊< br>[ 3 ]
。酶的固定化方法主要有：包埋

。

木瓜蛋白酶 （
Papain
）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（
Caric a
papaya
）
果实中的乳汁，
采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然 生物酶制品。
它是一种含
疏基
(-SH)
肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活 性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多
肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能， 能把蛋白水解物合成为类蛋白
质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇 、氯仿和乙醚等
有机溶剂。
最适合
PH
值
5.7(
一般3
～
9.5
皆可
)
，
在中性或偏酸性时亦有作用，等电点
18.75
；
最适合温度
55
～
60
℃
(
一般
10
～
85
℃皆可
)
，耐热性强， 在
90
℃时也不会完全失活；受氧化
剂抑制，还原性物质激活。

一、木瓜蛋白酶的固定方法

1

包埋法固定

包 埋法
:
将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中
,
使酶固定化的方法称为包埋法。凝 胶包埋法
是将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中
,
制成一定形状的固定化酶的方法。最常 用的凝胶有琼
脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜
中
,
制成微胶囊固定化酶的方法。

1.
1

海藻酸钠
-
壳聚糖固定化木瓜蛋白酶
(
Immobilized
papain
on
sodium
alginate
-
chitosan,IPSAC)
海藻酸是从褐藻提取的
,
是甘露糖醛酸以
β

-1, 4
键相连接的多糖类物质
,
它是包埋酶较
为理想的载体
,
其固定化方法较为简单
,
条件温和
,
操作可在室温下进行
,
酶很少失活。但是
,
海
藻酸钙凝胶在含多价阴离子
(
磷酸盐、柠檬 酸盐、乳酸盐等
)
的溶液以及高浓度电解质
( K+ ,
Na+
)
溶液中不稳定
,Ca2
+
离子易脱落
,
凝胶 变软
,
甚至溶解。何平等
在研海藻酸钠
-
壳聚
糖固定化木 瓜蛋白酶时一方面在制作凝胶时使用
Tris
盐酸缓冲液
,
减少
Ca 2
+
子的脱落
,
保持
凝胶的稳定
;
另一方面首次 通过加入壳聚糖粉末来提高凝胶硬度
,
壳聚糖上的正电荷
( - NH+3 )
与海藻酸的羧基相互作用
,
起到稳定凝胶的作用
,
适用于装柱使用
,
与不加壳聚糖粉末的固定
[ 4 ]
化酶酶活性相同。在何平等
的研究中
, PA
与
IPSAC
的最适
pH
值均为
7. 2,
在
70
℃以下活
性稳定
;
经包埋的
PA
空间结构没有 发生变化
,
故最适
pH
值及热稳定性基本没变。
IPSAC
半衰
期为
59
d
。海藻酸钠
-
壳聚糖固定化木瓜蛋白酶
(
IPSAC)
,
其热稳定性好
,
半衰期长
,
凝胶
硬度较高
,
可用于装柱使用
,
便于工厂中自动化生产。

2

吸附法固定

吸附 法
:
利用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为吸附
法。< br>常用的吸附剂有活性炭、
氧化铝、
硅藻土、
多孔陶瓷、
多孔玻璃、硅胶、
羧基磷灰石等。
吸附法制备固定化酶
,
操作简便、
条件温 和
,
不会引起酶的变性失活
,
载体价廉易得
,
而且可反复< br>使用。由于靠物理吸附作用
,
结合力较弱
,
酶与载体结合不牢固、易脱 落
,
所以在实际生产中运
用较少
,
这方面的研究也较少。

2. 1

冷冻
-
真空吸附法在介孔材料中固定木瓜蛋白酶

介孔分子筛孔道里组装功能材料的方法有多种
,
常见的有气相吸附、浸渍法等
,
与普通
吸附方法相比
,
冷冻
-
真空吸附法是一种新的方法
,
其优点为
:
一是驱动力大
,
吸附蛋白量
会更大
;
二是在低温状态下可保持酶蛋白的活性。高波等
以介孔材料
SBA - 15
为载体制
备固定化木瓜蛋白酶。对固定化酶和溶液酶的特性进行对比
,
发现木瓜蛋白酶 被固定后最适
[ 6 ]
[ 4
]
温度由
60
℃提高到< br>70
℃。酶被固定后最适
pH
值为
7.
0,
最适
pH
值没有改变
,
这可能是介
孔分子筛
SBA - 15
的表面电荷性质接近中性所致。
取一定量固定化酶和溶液酶
,
在
30
～
90
℃
水浴条件下保温
30 min,
迅速冷却至室温后
,
再在
37
℃下测定酶活力。
将木瓜蛋 白酶组装进
分子筛后其热稳定性明显增强
,
即使在
90
℃保温
30
min
仍保留
70%
的活力
,
而溶液酶在
90
℃已经失活
,
说明酶组装进分子筛后可以提高热稳定性。
由于高温不仅可以提高反应速度
,
降低细菌的污染几率
,
还可以提高底物的溶解度
,
从而提高产率
,
因此以介孔材料
SBA
-
15
为载体制备的固定化酶所具有良好的热稳定性将更有利于生产应用。

实验结果表明
,
在合适的真空度下
,
用冷冻
-
真空吸附法可以制备出组装量高的固定化
酶
,
而且酶的活性仍然保持良好
,
稳定性高
,
因此冷冻
-
真空吸附可以作为一种新方法用于
固定酶蛋白。

3

共价偶联法固定

共价偶联法
:
利用酶活性中心外的非必需基团与固 相载体上的基团共价结合而制成固定
化酶的方法叫共价偶联法
,
也叫共价结合法。共价 结合法是目前研究最活跃的固定化方法之
一。它的优点在于酶与载体结合牢固
,
不易脱 落
,
可以连续使用较长时间。
但也存在以下缺陷
:
(1)
在固定化过程中酶分子与载体分子之间发生直接
(
刚性
)
碰撞
,
易使酶的构象改变
,
使酶失
活
;
(2)
载体一般是疏水性物质
,
当酶直接被固定在疏水载体上时会改变酶的 微环境
,
使酶蛋
白构象发生折叠、失活
; (3)
传统共价结合法 得到的固定酶自由度低
,
酶分子和底物之间存在
较大空间位阻
,
不利 于保留酶游离态的均相催化活性。故称之为

刚性固定化

。

共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、
甲壳素等。
这里重点介绍几种比较
新的共价偶联法固定木瓜蛋白酶。

3. 1

双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶

针对共价偶联法存在的问题
,
有人想 到了在载体表面接上短链
(
手臂分子
)
进行酶的

手
臂固定化

。
但由于这种手臂链是分子量较小的短链
,
而且有些是碳 链构成的疏水链
,
所以在固
[ 7 - 8 ]
定化过程中
,
酶分子仍会受到较大的冲击力
,
使构象改变而失活。汪海萍、魏荣卿等
提出

柔性固定化酶

模型
,
即
:
在固定化载体上
,
接上一些有足够长度且是亲水的分子链
,
即所谓的

柔性链

而后再将酶结合到柔性链上
,
采用以下步骤实现木瓜蛋白酶的柔性固定化
,< br>见图
1
。

采用酶柔性固定化模型
,
选用壳聚糖、< br>双醛淀粉制得的柔性载体
(Chitosan - DAS50) ,
对木
瓜蛋 白酶进行柔性固定化
,
所得的固定化酶活力回收率达
72%
,
相当于采用壳聚糖
-
戊二醛
(Chitosan - GA)< br>手臂载体的
3
倍
,
柔性固定化木瓜蛋白酶使用
7
～< br>8
批次后仍保留一半的活力
,
储存稳定性也远远高于游离酶。

结果表明
,

柔性固定化

方法不仅可减少酶在固定化过程中 的失活
,
而且使所得到的固
定化酶仍具有游离酶较高的均相催化活性。


图
1

柔性固定化木瓜蛋白酶合成路线

3.2

金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶

金属螯合亲和层析
(
Immobilied
metal
ion
affinitychromatography,
简称
IMAC)
,
是利用金