经期能吃中药吗固相萃取-高效液相色谱串联质谱法

2021年1月29日发(作者：金色葡萄球菌)

固相萃取
-
高效液相色谱串联质谱法

测定原料奶中
5
种环境雌激素残留量的研究

李雪
1,2< br>，牟光庆
1
，陈历俊
1,2,*
，姜铁民
2

（
1.
大连工业大学食品学院，辽宁大连
116034
；

2.
北京三元食品股份有限公司，北京
100076
）


摘要
：建立固相萃取
-
高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌 酮、雌二醇、
雌三醇、己烯雌酚、双酚
A
）的方法。原料乳用
NH
2
-SPE
固相萃取小柱进行富集，旋转蒸
发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定 。实验结果表明：各待测物在
0.01 ~0.5
μg/
mL
范围内具有良好 的线性关系，相关系数均大于
0.9978
，加标回收率为
68.5%~105.6%
，
RSD
为
2.56%~7.59%
，最低检出限为
0.2 2 ~0.56
μg/
L
（
S/N=3
）
。本方法操作简便 ，快速灵敏，适
合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。

关键词
：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测

Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in
raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography
tandem mass spectrometry

LI Xue
1,2
,MU Guang-qing
1
,CHEN Li-jun
1,2,*
,JIANG Tie-min
2
（
1.

College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China;

2.

Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China
）

Abstract
:
A
solid
phase
extraction-high
performance
liquid

chromatography
tandem
mass
spectrometry
method
for
simultaneous
determination
of
environmental
estrogens
including
estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of
environmental
estrogens
were
extracted
from
the
raw
milk
sample
by
a
NH
2
-SPE
column,
and
concentrated
with
a
rotary
evaporator.
The
extract
was
analyzed
by
high
performance
liquid
chromatography
tandem
mass
spectrometric
.
Results
showed
that:a
good
linear
range
from
0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was extraction recovery
were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection
was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The descri
bed method was simple,sensitive and accurate.

*
通讯作者：陈历俊，
chlj@
。

作者简介：李雪
(1986-)
，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。

基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部

“
863
”计划
(2011AA100903)
。




Key
words
:
high
performance
liquid
chromatography
tandem
mass
spectrometry;
solid
phase
extraction environmental estrogens; raw milk; residue detection
中图分类号：
TS252.1




文献标识码：
A

环境雌激素
[1-2]
属于环境内分泌 干扰物，是指由于人类活动而释放发到环境
中的一类有害化学物质，
这些物质进入生物体后能够 扰乱生物体内分泌功能，
通
常被称为“外因型内分泌扰乱化学物质”
。原料奶的质量是 乳制品的根本，是保
证奶制品食用安全、维护人类健康的基础。原料乳中是否存在雌激素至关重要，其中若残留激素，则对人体有一定的毒性
[3]
。

作者对原料乳中5
种雌激素进行了分析检测，
其中既有内源性雌激素
（雌酮、
雌二醇和雌 三醇）也有环境雌激素（己烯雌酚和双酚
A
）
，都属于人工合成或自
然界存在 的，
它们可通过食物链或直接接触等多种途径进入体内，
模拟动物体内
内源性激素，< br>具有协同或拮抗正常的内源性激素的作用，
干扰内分泌功能，
多被
称为环境雌激 素。

近来，对牛乳中环境激素检测的研究较多，常用的方法有：气相色谱
-
质谱
（
GC-MS
）法、高效液相色谱（
HPLC
）法、酶联免疫吸 附测定（
ELISA
）法、
荧光分析法等
[4-11]
。
例 如张红英等人
[11]
的研究是在有机溶剂提取的基础上对样品
进行衍生，然后采用气 相色谱
-
质谱法检测原料乳，但是前处理过程复杂，并且
接触大量的有毒试剂，
需要长时间的衍生化过程。
而本文用固相萃取替代衍生过
程，优化了提取、净化、色谱测定等 参数，成功建立了固相萃取、
LC-MS
测定
原料乳中
5
种环境雌激 素残留量的方法。
不仅提高了分析样品的工作效率，
还在
优化前处理方法的基础上，取 得了比较满意的结果。

1
材料与方法


1.1
材料与仪器

原料奶

采自北京市
11
个不同的奶牛养殖场；雌三醇标准品

纯度
97.4%
、
雌二醇标准品

纯度
96.7%

中国药品生物制品检定所；
雌酮标准品

纯度
99.5%
、
双酚
A
标准品

纯度
98.5%

德国
Dr.
Ehrenstorfer
公司；己烯雌酚标准品



纯
度
99.7%
，中国计量科学研究院；甲醇

HPLC
级、乙腈

LC/MS
级


美 国
Fisher
公司；氮气、氩气（
>99.999%
）
；超纯水< br>
美国
Milli-Q
纯水系统制；其他试剂均


为市售国产分析纯试剂。

ACQUITY
Ultra
Performance
LCTM
超高效液相色谱仪、
Quattro
Premier
Micromass
质谱仪、
MassLynx
数据处理系统
美国
Waters
公司；
KQ-500DE
医用
数控超声波清洗 器

昆山市超声仪器有限公司；
Sigma 2K-15
高速冷冻离心机

博
劢行仪器有限公司；
Cleanert NH
2
-SPE
固相萃取柱

500mg/3mL
美国Agela
公司；
旋转蒸发仪
RE-52A
上海振捷实验设备有限公司；
SHB-
Ⅲ型水循环真空泵

郑州
市上街区仪器厂。

1.2 LC-MS/MS
条件

1.2.1

色谱条件


色谱柱：
ACQUITY UPLCTM HSS T
3
（
2.1< br>×
50mm
，
1.8
μ
m
）
；
流动 相：乙腈
-
甲醇（
4
：
1
，
A
）与
0.01%
氨水（
B
）
，流速
0.3mL/min
，梯度 洗脱
程序见表
1
；柱温
35
℃；样品室温度
25
℃ ；进样量为
10
μ
L
。

表
1
梯度洗脱程序

Table.1 The program of gradient elution
时间（
min
）

0
3.0
5.0
5.5
5.6
8.5
A
（
%
）

40
50
80
80
40
40
B
（
%
）

60
50
20
20
60
60
梯度变化曲线


6
6
6
6
6
1.2.2

质谱条件


电喷雾离子源；负离子扫描模式 ；毛细管电压
2.37kV
；离子源
温度
120
℃；去溶剂气温度< br>450
℃；去溶剂气流量
800L/h
；锥孔气流量
50L/h
；
碰撞气体为氩气，
碰撞气流速度为
0.14mL/min
，
多反 应检测
（
MRM
）
模式检测。

1.3
标准溶液的配制

分别称取标准品
10.0mg
于
10mL
容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释定容，得
到质量浓度为
1.0g/L
的单标准 储备溶液，于
-20
℃冰箱保存备用。分别取上述储
备液用乙腈
-
水 （
1:1
，
v/v
）或乙腈
-0.01%
氨水（
1 :1
，
v/v
）稀释为
1mg/L
的标准
溶液用来优化质谱 条件。

各取单标准储备液适量，
用初始流动相做稀释液配制所需浓度的混合标准溶


液。

1.4
样品前处理

量取
2mL
原料奶样品于
15mL
离心管中，
加入
10mL
乙腈，
漩涡 混匀
1min
，
于
25
℃超声
25min
，在4
℃下以
12000r/min
离心
10min
，移取上清液， 待上清液
恢复至室温后过
NH
2
柱。在
NH
2
柱中 加入约
2cm
高无水硫酸钠（经
650
℃烘烤
4h
，
保存在干燥器内，
冷却后备用）
，
下接旋转瓶放在固定架上。
加样前先用< br>4mL
乙腈
-
甲苯（
3
：
1
）预洗柱，当液 面到达硫酸钠的顶部时，迅速将上清液转移到
净化柱上，再用
25mL
乙腈
-
甲苯（
3
：
1
）洗涤柱子，收集所有流出物于旋转瓶
中并在
40
℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干。
用
1mL
乙腈
/
甲醇
4:1-0.01%
氨水
（
2:3
，
v/v
）溶液溶解残渣，经
0.22
μ
m
滤膜过滤，移入
1.5mL
自动进样器样品瓶中，
供
HPLC-MS/MS
测定。

2
结果与讨论

2.1
样品处理方法的选择

2.1.1
提取溶剂的选择

这
5
种环境雌激素都属于疏水性有机化合物 ，
易溶于
大多数有机溶剂。本实验采用超声提取方式对样品进行提取，先后比较了甲醇、
叔丁基甲醚、
乙腈和乙酸乙酯
4
种溶剂的提取效果，
得到
5
种环境雌激素的回收
率，如图
1
所示。结果发现，乙腈能有效沉淀蛋白质，其总提取 效率最高，且提
取液清澈，
本地干扰少；
由于牛乳本身含有很多脂溶性化合物，
以叔丁基甲醚和
乙酸乙酯为提取剂时乳化现象严重，即使在
12000r/min
条 件下离心
10min
也不
能很好的消除乳化现象，
从而造成提取液中含有大量 的杂质，
给接下来的净化工
作带来了很大的困难，
而且乙酸乙酯提取环境雌激素的回收 率低于
20%
；
甲醇提
取效果没有乙腈好，
且甲醇很难与水相分层，
提取液中残存少量杂质，
不利于净
化过程，
易造成固相萃取小柱堵塞。
实验也考察了在提取过程中加入三氯乙酸和
0.1%
乙酸溶液对蛋白质和脂肪的沉淀效果，< br>以期能得到更纯净的提取液，
结果表
明，加入
0.1%
乙酸溶液的样品 过固相萃取柱时会使小柱堵塞；而加入三氯乙酸
溶液的样品提取率反而降低，
因此，
选 择乙腈作为本实验的提取溶剂。
通过不同
提取温度（
20
℃、
25< br>℃、
30
℃）和超声时间（
20min
、
25min
、
30min
）对提取效
率的影响发现，在
25
℃下超声
2 5min
时提取效率最高，故本实验选择在此条件
下进行提取。




图
1

提取溶剂对牛奶样品中
5
种环境雌激素回收率的影响

Fig.1 Influence of selected solvents on the recoveries of 5 environmental estrogens in bovine milk
注：
1
雌酮
(Estrone);2.
雌二醇
(Estradi ol);3.
雌三醇
(Estriol);4.
己烯雌酚
(Diethyls tilbestrol);5.
双酚
A(bisphenol A);A.
乙腈
(Acetonetrile);B.
乙酸
-
乙腈
(Acetic acid-acetonetrile,1:99,v/v);C.
三氯乙酸
-
乙腈< br>(Trichloroacetic
acid-acetonetrile,1:9,v/v) ;D.
甲醇（
Methanol);E.
叔丁基甲醚
(Tert-butyl
methyl ether);F.
乙酸乙酯（
Ethyl acetate).
2.1.2
固相萃取净化条件的选择

通过实验，比较了
PE P
柱、
C
18
柱和
NH
2
柱
的净化效果，
发现
3
种固相萃取小柱对这
5
种化合物有不同的吸附能力，
回收率
范围在
25%~105%
之间，其中
NH
2
小柱的平 均回收率最高，均在
68%
以上，且
结果稳定，见图
2
。这可能是由 于
NH
2
柱作为正相萃取柱，其键合硅胶填料极性
相对较强，
更适合 从非极性溶剂中提取弱极性到中等极性物质，
通过用非极性有
机溶剂活化和洗脱，
能很 好地将目标物洗脱下来，
而牛乳中强极性表面活性物质
仍吸附在小柱上，
再通过旋转蒸 发浓缩和溶剂交换，
可以除去样品中的非极性干
扰物质。文献报道，采用
C
1 8
或
HLB
柱净化激素类药物时，上样溶液的组成影
响回收率和净化效果，而 通常采用再与
NH
2
柱双结合的方式进一步进化
[12]
。通
过实验证明，乙腈不仅洗脱回收率高，净化效果也好，且只需
NH
2
柱即可达到净化目的，因此本实验选择
NH
2
柱最为固相萃取净化小柱。



120
100
回
收
率
(
%
)< br>R
e
c
o
v
e
r
y
(
%< br>)
A
B
C
80
60
40
20
01
2
3
4
环境雌激素
Environmental estrogen
5

图
2

固相萃取柱对牛奶样品中
5
种环境雌激素回收率的影响

Fig.2 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of 5 environmental estrogens
in bovine milk

注：
1
雌酮
(Estrone);2.< br>雌二醇
(Estradiol);3.
雌三醇
(Estriol);4.
己烯雌酚
(Diethylstilbestrol);5.
双酚
A(bisphe nol A);;B.C
18
;
2
.
2.2
色谱条件的优化

根据文献和实验证明，反相
HPLC
技术用于这< br>5
种环境雌激素的分析检测，
在此基础上选用
ACQUITY
UPLCTM
HSS
T
3
柱（
2.1
×
50mm
，
1.8
μ
m
）和
ACQUITY UPLCTM BEH C
18
柱（
2.1
×
50mm
，< br>1.7
μ
m
）作为分离色谱柱进行试
验。文献中报道，
BEH C
18
色谱柱属三键键合，适合在负离子电离模式条件下对
激素类物质的检测
[8]
，但由于不同的色谱柱对同一样品有不同的保留时间，经过
实验证明，
HSS
T
3
柱由于填料颗粒细，使峰形更加对称尖锐、信噪比更高，比
BEH C< br>18
柱更适合用于疏水性物质的分离检测，
且能将这
5
种目标物质全部 分离，
分析时间更短，
8.5min
即可完成
5
种物质的全部分离检 测，因此选用
ACQUITY
UPLCTM HSS T
3
柱作为分离色谱柱。

实验研究比较了在甲醇
-
水、乙 腈
-
水二元溶剂体系，以及流动相体系中分别
加入
0.1%
甲酸、< br>10mmol/L
乙酸铵、
0.1%
氨水、
0.01%
氨水等 对这
5
种环境雌激
素电离喷雾的影响。
实验发现，
以乙腈为流动相的 各环境雌激素信号响应强度稍
逊于甲醇，
但是峰形比甲醇要好，
且保留时间早，
而在乙腈中加入一定比例的甲