儿童肺炎治疗猪乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基础种子的全面鉴定

2021年1月29日发(作者：胡忠)


猪乙型脑炎病毒
SA14-14-2
疫苗株基础种子的全面鉴定




巢

伟，张桂红，徐

雷
*
（湖南中岸生物药业有限公司，长沙

410100
）


摘要
:

建立了猪乙型脑炎活疫苗基础种子库，对三批基础种子进行了全面鉴 定。结果表明，
三批猪乙型脑炎基础种子无外源病毒污染，
对敏感实验动物小鼠、
乳猪 和怀孕母猪接种均安
全、无异常反应，原代地鼠肾细胞传代至
F12
代，免疫原性保持 稳定、毒力不返强。由此
可见，
猪乙型脑炎
SA14-14-2
疫苗株基础种 子无外源病毒污染，
具有可靠安全性和良好、
稳
定的免疫原性，可用于疫苗生产，为研 制猪乙型脑炎活疫苗打下基础。

关键词：猪乙型脑炎病毒；
SA14-14-2
株；基础种子；全面鉴定

The Comprehensive Identification
for Foundation Seed of Swine Japanese Encephalitis Virus Vaccine Sal4-14-2 Strain

CHAO Wei, ZHANG Gui-hong, XU Lei
(Hunan Sinoland Bio- Pharmacy Co., Ltd, Changsha 410100, China)

Abstract:

To establish the foundation seed bank of swine Japanese encephalitis live vaccine and
finish
a
comprehensive
test
for
the
three
batch
foundation
seeds.
The
test
results
show
that
the
three
batch

foundation
seeds
of
Japanese
encephalitis
vaccine
are
not
polluted
by
exogenous
virus
and
safe,
no
abnormal
reaction
for
sensitive
mice,
pigs
and
pregnant
sows.
To
the
F12
generation cultured by primary hamster kidney cell, immunogenicity of the virus were stable and
strong virulence of the virus does not return. Therefore, foundation seeds of Japanese encephalitis
vaccine
SA14-14-2
strain
show
no
exogenous
virus,
reliable
security,
good
and
stable
immunogenicity, can be used for vaccine production and lay the groundwork for the development
of Japanese encephalitis live vaccine.
Key
words:
swine
Japanese
encephalitis
virus
；
SAl4-14-2
strain
；
foundation
seed
；

comprehensive identification

乙型脑炎
(Japanese
encephalitis
，
JE)
又称流行性乙型脑炎、日本乙型脑炎，简称乙脑，
是由乙型脑炎病毒
(Japanes e encephalitis Virus
，
JEV)
引起的致人和动物中枢神经系 统症状的
人畜共患急性传染病。
猪是主要宿主及传染源，
人成为间接宿主，
乙 脑病毒形成猪
—
蚊
—
人
的传播循环。
因此，
乙型脑 炎的防治研究不但对于猪的规模化养殖有重要的意义，
而且有重
要的公共卫生学意义。
1988
年，我国开始生产原代地鼠肾细胞乙脑减毒活疫苗（
SA14-14-2
株）
，与乙脑灭活疫苗相比，抗体阳转率较高，接种针次少，副反应明显降低。目前，该疫
苗是我国 广泛使用的乙脑疫苗，累积接种人数超过
1.5
亿
[1]
。兽用乙脑活疫苗的 应用，在国
内从七十年代起，将人医选育乙型脑炎减毒株
5-3
株用于猪，
2 -8
株用于马。由于两毒株各
自的缺陷及其它原因，
在九十年代以后停用。
受
SA14-14-2
减毒株十多年来在我国大面积推
广用于人群的成功经验，
拟将
SA14-14-2
株作为猪用乙脑弱毒株，
进行了一系列试验研究。


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作者简介：巢

伟，硕士，从事兽用生物制品的研发工作。

通讯作者：徐

雷。
E-mail:xuleiringpu@

1
材料和方法


1.1
试剂和细胞


三价荧光抗体
(
牛病毒性腹泻
/
黏膜病病毒（
B VDV/MD
）
、猪细小病毒
（
PPV
）
、猪瘟病毒（HCV
）
)
、绿猴肾（
Vero
）传代细胞、

PK15
传代细胞，由中国兽医药
品监察所提供。流行性乙型脑炎特异性抗血清、乙脑强毒< br>P3
株
(
腹腔接种
10~12g
小鼠半数
致死量≥10
7.5
LD
50
)
，由中国药品生物制品检定所提供。乙 脑诊断试剂盒由北京生物制品研究
所提供。原代地鼠肾细胞、牛睾丸细胞、
0.2%
红 细胞悬液（豚鼠红细胞、人
“O”
型红细胞、
鸡红细胞等量混合）
，本公司实 验室自制。

1.2
实验动物


乙脑抗体阴性的后备母猪 （体重
60~70kg
）
、妊娠
30
日健康易感初怀母猪及
4~8
日龄健康易感乳猪，本公司健康动物房提供。
SPF
级小鼠由湖南斯莱克景达实 验动物有
限公司提供。

1.3
基础种子批


猪 乙型脑炎病毒
SA14-14-2
疫苗株
F5
代、
F6
代、
F7
代冻干毒种，病毒含
量分别为
10
7.8
TCID50
/mL
、
10
7.6
TCID
50
/mL
、
10
7.7
TCID
50
/mL
，本公司种毒室 制备。

1.4
外源病毒检测

1.4.1
检验用原代 细胞制备：选用
10-14
日龄的
SPF
地鼠和
1~4
日龄 健康小公牛，按常规方
法制备地鼠肾原代细胞、牛睾丸细胞。分装于
25 mL
的方瓶，置
37
℃
培养，长满单层后备
用。

1.4.2
猪乙型脑炎冻干毒种与乙型脑炎特异性抗血清中和：将三批猪乙型脑炎基础种子冻 干
毒，每批取
2
瓶，分别用
PBS
液作
1000
倍 稀释，加入乙型脑炎特异性抗血清等量混合。置
37
℃
水浴中和
90 min
。

1.4.3
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》
2000
年版
[9]
“
外源病毒检验法
”
进行荧光抗
体法检查外源病毒、绿猴肾传代细胞检查外源病毒和红细胞吸附外源病毒试验。

1.4.4
用地鼠肾细胞检测伪狂犬病病毒：将中和后的猪乙型脑炎冻干毒种与血清的混合物接
种地鼠肾原 代细胞
4
瓶，培养
4d
传
2
代，每代
7d
，观察细胞病变。同时用伪狂犬病病毒
Bartha-K61
株接种地鼠肾原代细胞，每瓶加入 含
1000TCID
50
病毒的维持液
3 mL
，共接种
4
瓶作为阳性对照组。

1.4.5
用小鼠检测狂犬病病毒：取
1.4.4
项地鼠肾细胞传
2
代培养物 （伪狂犬病病毒检验阴
性）
，每批脑内注射
5~7
日龄乳鼠
5
只，每只
0.03 mL
。观察
7~10 d
，乳鼠不发病，并于第
7
d
剖杀其中
2
只，取鼠脑组织 制成
10%
悬液脑内接种
5-7
日龄乳鼠
5
只，如此盲传< br>3
代，最
后一代观察
14 d
，每代乳鼠健活为合格。


1.5
免疫原性检测

1.5.1
小鼠免疫原性试验


将三批猪乙型脑炎基础种子冻干毒，
用
PBS
液作
10
倍系列稀释，
选取
10
-3
~1 0
-5
三个稀释度，
分别皮下注射
10~12 g
小鼠
5
只，
0.1 mL/
只，
14 d
后分别以乙脑
强毒
P3
株腹腔攻击，
每只
0.3 mL< br>（含
≥500
个
LD
50
）
，
同时每只小鼠 脑内接种稀释液
0.03 mL
，
观察
14
日判定结果。对照小鼠死 亡率应
≥80%
，按
Reed-Muench
法计算半数保护剂量。

1.5.2
后备母猪的免疫原性试验


将猪乙型脑炎基础种子< br>F7
代冻干毒稀释至
10
4
~10
7
TCID50
免疫剂量，
分别肌肉注射
4
头健康敏感后备母猪。
免疫4
周后采血分离血清，
分别采用反向
血凝抑制试验和蚀斑减少中和试验测定抗体效 价。后备母猪免疫
4
周后配种，配种
40 d
后，
各肌肉注射乙脑强毒
P3
株
10
5.8
L D
50
（小鼠腹腔攻击测定
LD
50
）
。攻毒后
7 2 h
采血，接种原
代地鼠肾细胞培养检查病毒血症。攻毒
14
d
后，每组剖杀两头，观察胎儿成活情况，并取
胎儿脑及脾制成
10%
悬液接种原代地鼠 肾细胞分离病毒
[2]
。

1.6
毒力稳定性检测
将猪乙型脑炎原始种子（
F4
代）冻干毒在原代地鼠肾单层细胞培养传
代，连续传 代至
F12
代。分别选取
F5
代、
F8
代、
F10
代、
F12
代病毒培养液进行小鼠脑内
致病力试验，
小鼠皮下感染入 脑试验，
乳鼠传代返祖试验，
测定该毒株在原代地鼠肾细胞培