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革兰氏染色的一般步骤
革兰氏染色的一般步骤
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴
别染色法,
1884
年由丹麦医师
Gram
创立。
未经
染色之细菌,
由于其与周 围环境折光率差别甚小,
故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成
鲜明对比,可以清楚地 观察到细菌的形态、排列
及某些结构特征,而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法, 即将标本固定后,先
用结晶紫染色
1
分钟后水洗,然后加革兰碘液媒
染一分钟 后用酒精脱色,再用稀释石炭酸复红复
染。染色后除可以看到细菌形态外,还可将细菌
分为两大 类,即不被酒精脱色而保留紫色者为革
兰氏阳性菌(
G
)。被酒精脱色复染成红色者为
革兰氏阴性菌(
Gˉ
)。
革兰氏染色原理尚不肯定,可能与细菌所 带
核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有
关。致病菌如
金黄色葡萄球菌、绿色 溶血性链球
菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌
等属革兰氏
染色阳性菌。
百日 咳杆菌、大肠杆菌(大肠埃希
菌)、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍
乱弧菌、沙门菌、 流行性脑膜炎双球菌、淋病双
+
球菌
等均属革兰氏阴性菌。所以根据细菌的 革兰
氏染色性质,可以缩小鉴定范围,有利于进一步
分离鉴定,以对疾病做出诊断。又由于各种 抗生
素的抗菌谱不同,革兰氏染色尚可做为选用抗生
素的参考。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、
复染等四个步骤,具体操作方法是:
1
)涂片固定。
2
)草酸铵结晶紫染
1
分钟。
3
)纯化水冲洗。
4
)加碘液覆盖涂面染
1
分钟。
5
)水洗,用吸水纸吸去水分。
6
)加
95%
酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,
30
秒后水洗,吸去水分。
< br>7
)番红染色液
(稀)染
10
秒钟后,纯化水冲洗。
干燥,镜 检。
染色的结果,
革兰氏< br>正反应
菌体都呈
紫色
,
负反应
菌体都呈
红色
。
实验三
细菌的革兰氏染色法
一、目的要求
了解革兰氏染色的原理,学习并掌握革兰
氏染色的方法。
二、基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要
性状。
它是
1884
年由丹麦医师
Gram
创立的。
革
兰氏染色法(< br>Gram
stain
)不仅能观察到细菌的
形态而且还可将所有细菌区分为两 大类:染色反
应呈
蓝紫色
的称为革兰氏
阳性
细菌,用
G+< br>表示;
染色反应呈
红色
(复染颜色)的称为革兰氏
阴性
细菌, 用
G-
表示。细菌对于革兰氏染色的不同反
应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而 造成
的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形
成的网状结构组成的,在染色过程中,当用 乙醇
处理时,
由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,
通透性降低,
使结晶紫
-
碘复合物被保留在细胞内
而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细
菌 的细胞壁中肽聚糖含量低,
而脂类物质含量高,
当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细 胞壁的通透
性增加,使结晶紫
-
碘复合物易被乙醇抽出而脱
色,然后又被染上 了复染液(番红)的颜色,因
此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染
料(
basic dy e
)初染液;媒染剂(
mordant
)
;脱
色
剂
(
decoorising
agent
)
和
复
染
液
(
counterstain
)
。
碱性染料初染液的作 用象在细菌的单染色
法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的
初染液一般是结晶紫(crysta vioet
)
。媒染剂的作
用是增加染料和细胞之间的亲和性或附 着力,即
以某种方式帮助染料固定在细胞上,
使不易脱落,
碘
(
io dine
)
是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色
的细胞进行脱色,
不 同类型的细胞脱色反应不同,
有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用
95
%的
酒精(
ethano
)
。复染液也是一种碱性染料,其颜
色不同于初染液, 复染的目的是使被脱色的细胞
染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍
然保持初染的颜色 ,从而将细胞区分成
G+
和
G-
两大类群,常用的复染液是
番红。
三、器材
大肠杆菌,金黄色葡萄球菌;
草酸铵结晶紫,番红水溶液,碘液,
95%
乙醇,载玻片,显微镜等。
四、操作步骤
1
.涂片
将培养< br>24
小时的金黄色葡萄球菌和大肠
杆菌分别作涂片
(注意涂片切不可过于浓厚)
,
自
然干燥、固定。固定时通过火焰
1
~
2
次即可 ,不
可过热,以载玻片不烫手为宜。
2
.染色
(
1
)初染:滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆
盖为宜)一滴,染色< br>1-2min
,倾斜后缓慢冲洗,
用吸水纸吸干。
(
2
)媒染:滴加碘液冲去残水,并覆盖 约
一分钟,倾斜后缓慢冲洗,吸水纸吸干。
(
3
)脱色:将载玻片上面的水甩净,并衬
以白背景, 倾斜玻片,用
95
%酒精滴洗至流出酒
精刚刚不出现紫色时为止,
约
20
~
30
秒钟,
立即
用水冲净酒精。
(
4
)复染:用番红液染1
~
2
分钟,水洗。
(
5
)镜检:自然干燥后,置油镜观察。革
兰氏
阴性
菌呈
红色
,革兰氏阳性菌呈紫色。以分
散开的细菌的革兰氏染色反应为 准,过于密集的
细菌,常常呈假阳性。
(
6
)
同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄
色 葡萄球菌混合制片,作革兰氏染色对比。
注意:
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒
精脱色程度,如脱色过 度,则阳性菌可被误染为
阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性
菌。此外,菌龄也影响 染色结果,如阳性菌培养
时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常
呈阴性反应。
五、实验结果与讨论
微生物染色液的配制
一、吕氏
(Loeffler)
碱性美蓝染液
A
液:美蓝
(methylene blue) 0
.
6g
95%
酒精
30ml
B
液:
KOH 0
.
01g
蒸馏水
100ml
分别配制
A
液和
B
液,配好后混合即可。
二、齐氏
(Ziehl)
石炭酸复红染色液
A
液:碱性复红
(basic fuchsin) 0
.
3g
95%
酒精
10ml
B
液:石炭酸
5
.
0g
蒸馏水
95ml
将碱性复红在研钵中研磨后,逐 渐加入
95%
酒精,继续研磨使其溶解,配成
A
液。
将石炭酸溶解于水中,配成
B
液。
混合
A
液及
B
液即成。
通常可将此混 合液稀
释
5
—
10
倍使用,稀释液易变质失效,一次不宜
多 配。
三、革兰氏
(Gram)
染色液
1
.草酸铵结晶紫染液
A
液:结晶紫
(crystal violet) 2g
95%
酒精
20ml
B
液:草酸铵
(ammonium oxalate) 0
.
8g
蒸馏水
80ml
混合
A
、
B
二液,静置
48
小时后使用。
2
.卢戈氏
(Lugol)
碘液
碘片
1
.
0g
碘化钾
2
.
0g
蒸馏水
300ml
先将碘化钾溶解在少量水中,
再将碘片溶解
在碘化钾溶液中,待碘全溶后,加足水分即成。
3
.
95%
的酒精溶液
(
脱色用
)
。
4
.番红复染液
番红
(safranine O) 2
.
5g
95%
酒精
100ml
取上述配好的 番红酒精溶液
10ml
与
80ml
蒸
馏水混匀即成。
四、芽孢染色液
1
.孔雀绿染液
孔雀绿
(malachite green) 5g
蒸馏水
100ml
2
.番红水溶液
番红
0
.
5g
蒸馏水
100ml
3
.苯酚品红溶液
碱性品红
11g
无水酒精
100ml
制法取上述溶液
10ml
与
100ml5%
的苯酚溶
液混合,过滤备用。
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