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细胞培养上清的收集

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-27 05:26

肚脐眼抠漏了-

2021年1月27日发(作者:卢端)
消可宁对葡萄糖诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶表达变
化的抑制作用




摘要


目的

探讨消可宁 对葡萄糖(
GS
)诱导血管内皮细胞诱生型一氧化
氮合酶

iNOS

表达变化的影响。
方法

培养人脐静脉内皮细胞株
ECV304
细胞,

30 mol/L GS
处理
3h

用生理盐水、
10
-7

mol/L CCK8

0
?


mg/L GS+10
-6、
10
-7、10-8

mol/L CCK8
处理
16 h
;用比色法检测培养液中一氧
化氮
(NO)< br>含量、细胞
NOS
活性,免疫细胞化学及蛋白质免疫印迹法检测
iNOS
蛋白表达。
结果

与生理盐水处理的对照组比较,
GS
诱导培养 液
NO
含量增多、
细胞
NOS
活性增高、
iNOS
蛋白表达上调;
CCK8
剂量依赖性抑制
GS
的上述效应,
而单独作 用对
iNOS
蛋白表达、
NOS
活性和
NO
含量均无明显影 响。
结论

CCK8
可以明显抑制
GS
引起
EC V304
细胞
iNOS
蛋白表达上调,减少
NO
生成。


【关键词


消可宁;葡萄糖;一氧化氮合酶;血管内皮细胞

Inhibitory effect of cholecystokinin octapeptide on
lipopolysaccharideelicited inducible nitric oxide synthase expression
in vascular endothelial cells

?Department of Forensic Medicine and
Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017,
Hebei, China (YAN Jun works at Department of Pathophysiology,
Nankai Hospital, Tianjin 300100, China)Corresponding author: GU
Zhenyong (Email: zhenyong88@)


Abstract


Objective

To investigate the effect of cholecystokinin
octapeptide

on lipopolysaccharide (GS)elicited inducible nitric oxide synthase
(iNOS) expression in vascular endothelial cells.
Methods
Human umbilical vein
endothelial cell line (ECV304 cells) was stimulated with vehicle (normal saline)
or GS in the presence (0
?01, 0?1, 1 mg/L) or absence (0?1 mg/L) of CC
K8
(10

6

10

8 mol/L). Nitric oxide (NO) level and cellular nitric oxide synthase
(NOS) activity were determined with spectrophotometrically. The iNOS
expression was detected with immunocytochemical technique and Western
blot.
Results

Compared with normal saline, GS significantly induced the
upregulation of iNOS protein expression in the cultured ECV304 cells, and NOS
activity in ECV304 cells and NO level in cultured media were increased. CCK8
obviously inhibited abovementioned effect of GS in a dosedependent manner.
Whereas CCK8 alone did not showed effect on iNOS protein expression, NO
level and cellular NOS activity as compared with those values when vehicle was
used.
Conclusion

CCK8 inhibite GSelicited iNOS expression and NO
production in ECV304 cells.


Key words


cholecystokinin octapeptide;lipopolysaccharide

nitric oxide
synthase;vascular endothelial cell


研究发现,血管内皮细胞不仅构成血管的机械性保护屏障,还可合成多种血管活性物质如一氧化氮(
NO
),调节血管的张力和反应性变化〔1〕。已经
证 实,
NO
是内皮衍生舒血管因子

EDRF

的主要化学物 质,
一氧化氮合酶

NOS


NO
生成的限速酶 。在生理条件下,内皮细胞主要存在内皮型一氧化氮合酶

eNOS
),
NO
生成量较少,主要发挥调节血管张力、防止血小板黏附等生理功
能;而当内毒素葡萄糖
(GS)
及促炎细胞因子等刺激血管内皮细胞时,可诱导血管
内皮细胞诱生型一氧化氮合酶(iNOS)
表达上调,
NO
生成量明显增多。过量生成

NO
及其衍生物过氧亚硝基阴离子均具有细胞毒效应,可导致细胞损伤。在内
毒素休克发病过程中, 血管内皮细胞
NO
的生成、释放及其生物学效应异常是血
管内皮细胞损伤和内皮功能异 常的关键环节〔
2

3
〕。保护血管内皮已经成为治
疗休克的重要途 径。消可宁是一种分布广泛的神经调节肽,具有抗休克、缓解内
毒素休克血管动力学紊乱和细胞保护作用 〔
3
〕。我们以往研究发现,
CCK8
对内
毒素休克时肺循环和体循 环血管或内毒素处理离体血管的张力和反应性变化具
有明显的调节作用,可改善
NO
介 导的血管内皮依赖性舒张反应降低〔
4
〕,抑

GS
诱导的肺动脉内 皮细胞凋亡,减少
NO
衍生的强效氧化剂和硝基化因子过
氧亚硝基阴离子的生成〔5
〕,提示
CCK8
的作用可能与其改变血管内皮细胞的
NO
生 成、释放或生物学效应有关。迄今为止,
CCK8
对血管内皮细胞
NO
生成变
化及
NOS
的影响尚未见报道。
本实验中在细胞水平观察
CCK8< br>对
GS
诱导人脐静
脉内皮细胞株
ECV304
细胞
i NOS
变化的调节作用,探讨
CCK8
缓解内毒素休克
血管动力学紊乱、减轻 血管内皮依赖性舒张反应降低的分子机制。

1
材料与方法

1.1
药品及试剂
:CCK8

GS

Sig ma
产品;
细胞培养液
RPMI1640

GIBCOBRL
产品;
NO

NOS
试剂盒为南京建成生物公司产品;
兔抗人iNOS
多克隆抗体
(


)
为美国
Sant a Cruz
公司生产;辣根过氧化物酶
(HRP)
标记的山羊抗兔
IgG(


)
为美国
Vector
公司生产;免疫组化试剂盒和< br>3

3′
二氨基联苯胺
(DAB)
显色试
剂盒均为北 京中山生物公司生产;其他试剂均为国产分析纯。

1.2
细胞培养及预处理:< br>人脐静脉内皮细胞株
ECV304
细胞购自武汉大学动植物
特殊菌种保藏中心。 细复苏之后,用
RPMI1640
完全培养液
(
含体积分数为
10%
的胎牛血清、
100 kU/L
青霉素、
100 kU/L
链霉素< br>)
将细胞数调为

109/L
,接种

25 ml
培养瓶中,在
37
℃、体积分数为
5%

CO
2和
95%

O
2条件下培
养,
3 d
传代
1
次。细胞传代后
36~48 h
,当细胞长至培养瓶的80%~90%
时开
始给予刺激因素。细胞分为
4
组:①溶剂对照组(
对照组
)
:培养液中加入生理盐
水;

GS
组:
培养液中加入终浓度分别为
0
?01

0
?1

1 mg/L

GS


CCK8
组:培养液中 加入终浓度为
10

7 mol/L

CCK8
;④
GS+CCK8
组:在培养液中
同时加入终浓度分别为
10

6< br>、
10

7

10

8 mol/L

CCK8

0
?1 mg/L

GS

GS
组动态观察
2

24 h
,其余各组观察
16 h
,每个时间点
4
个复孔。

1.3
细胞培养上清的收集及细胞匀浆制备:将细胞培养液以850
×
g
离心
3
min
,收集上清于试管中,置于
70
℃超低温冰箱中冻存备用;收集细胞,以细
胞裂解液〔
0.1 mmol/L TrisHCl
缓冲液,
pH 7.4

0.1 mmol/L
乙二胺四乙酸
(EDTA),0.5 mmol/L
二硫苏糖醇
(DTT)

0.1 mmol/L
乙二醇四乙酸酯
(EGTA),1
μmol/L
抑胃肽
A

1 mmol/L
苯甲基磺酰氟
(PMSF)

2 μmol/L
亮抑胃蛋白酶肽〕
裂解细胞,冰浴中超声破碎细胞,于
4
℃、
20 000×
g
离心
60 min
,上清为细胞
匀浆,细胞匀浆蛋白含量用考马斯亮蓝法检测。


1.4
观察指标

1.4.1
细胞
NOS
活性及上清
NO
含量检测:采用试剂盒检测,操作按说明书进
行。
NOS活性以每克蛋白中
NOS
活性
(kU/g)
表示,
NO
含量以
NO
的代谢产物
NO
-2/NO-3表示。

1.4.2
免疫细胞化学检测
iNOS
蛋白表达:按照免疫组化试剂盒说 明书操作。
ECV304
细胞于盖玻片上贴壁生长,加入前述药物处理细胞。用体积分数为95

的乙醇固定
30 min
,体积分数为
3
%的过 氧化氢
(H

O

)
室温孵育细胞爬片
10
min
,以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗,
0
?01 mol/L
磷酸盐缓冲液
(PBS

pH 7
?4)

5 min
。正常血清工作液孵育细胞爬片
15 min
,以减少非特异
性染色,然后倾去液体、勿洗。滴加用
0
?01 mol/L PBS(pH 7?4)1

100
稀释
的一抗,
4
℃过夜。
0.01 mol/L PBS(pH 7
?4)

3
次,每次
3 min
。滴加生物素
标记的二抗,
37
℃孵育
15 min

0.01 mol/L PBS(pH 7.4)

3
次,每次
3 min

滴加
HRP
标记的链霉卵白素工作液,
37
℃孵育
15 min

0.01 mol/L PBS (pH 7.4)

3
次,每次
3 min

DAB
显色
5 min
,达到要求颜色深度时,以蒸馏水
/
自来水

肚脐眼抠漏了-


肚脐眼抠漏了-


肚脐眼抠漏了-


肚脐眼抠漏了-


肚脐眼抠漏了-


肚脐眼抠漏了-


肚脐眼抠漏了-


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