中药复方PC―SPES Ⅱ抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖及其对AR, PSA表达的影响

2021年1月26日发(作者：甄伟)
中药复方
PC
―
SPES
Ⅱ抑制人前列腺癌细胞
LNCaP
增殖及
其对
AR, PSA
表达的影响






[
摘要
]
基于雄激素受体（
AR
）信号通路探讨中药复
方
PC-SPES < br>Ⅱ抑制人前列腺癌细胞
LNCaP
增殖的作用。
采
用
MTT< br>法检测
PC-SPES
Ⅱ对
LNCaP
细胞增殖的影响，显
示
PC-SPES
Ⅱ质量浓度为
180
～
1 440
mg?L^;-1
时能显著抑制
LNCaP
细胞增
殖，
PC-SPES
Ⅱ作用
24
，
48 h
的
IC< sub>50</sub>
分别为
311.48
，
199 .01 mg?L^-1;
流式细
胞仪检测细 胞周期分布的变化发现
240
mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ能阻滞 细胞于
G₂/M
期，在
G< sub>0</sub>/G₁
峰前出
现明显的凋亡峰，随作用时间的增加而升高
;
同时采用
Hoechst 33258
染色观察凋亡细胞形态和
Annexin V-FITC/PI
双染流式细胞仪检测凋亡细胞比例，
PC- SPES
Ⅱ质量浓度为
480 mg?L^-1 ;
时凋亡细胞比率增加，作
用效果均呈一定剂量依赖性
;
通过
ELI SA
法检测
LNCaP
细胞
分泌
PSA
的水平，以
25 mg?L^-1 Bic
作为阳性对照药，发现
480
mg?L^-1PC-SPES
Ⅱ能显著降低细胞
分泌
PSA;
采用
qRT- PCR
和
Western blot
方法检测
AR
，
PSA
mRNA
和蛋白表达的变化，结果显示以人工合成雄激素
25
μ
g ?L^-1R1881
诱导
LNCaP
细胞后，
240
～
480 mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ能显著
下调
AR
，
PSA mRNA
和蛋白表达，抑制< br>AR
由细胞质转移
入细胞核。以上结果表明，
PC-SPES
Ⅱ对< br>LNCaP
细胞体外
增殖有抑制作用，
阻滞细胞周期于
G2/M
期并诱导细胞凋亡，
其机制可能与下调
AR
，
PSA
的表达，抑制
AR
核转位有关。





[
关键词
]
前列腺癌
;PC-SPES
Ⅱ
;L NCaP
细胞
;
抑制增殖
;
雄激素受体
;
前列腺特 异性抗原




[
收稿日期
] 2014-07-03



[
基金项目
]
上 海市博士学位点建设科研项目
（
K110404
）
;
国家“重大新药 创制”科技重大专项（
2012ZX09401-014
）




[
通信作者
]
陈子
?B
，副教授，硕士生导师 ，研究方向为
中药复方配伍规律和肿瘤免疫药理，
Tel
：
（
021
）
51322187
，
E-mail
：
zjchen21@



[
作者简介
]
张碧严，硕士研究生，研究 方向为肿瘤和免
疫药理，
E-mail
：
zhang_bi_yan@



Effect of compound Chinese traditional medicine PC-SPES
Ⅱ

in inhibiting



proliferation of human prostate cancer cell LNCaP and



on expressions of AR and PSA



ZHANG Bi-yan
，

LI Yu- feng
，

LAI Yun
，

LI Yun- sen
，

CHEN Zi-jun



（
1. School of Chinese Materia Medica
，

Shanghai
University of Traditional Chinese Medicine
，

Shanghai 201203
，

China;



2. Institutes of Biology and Medical Sciences
，

Suzhou
University
，

Suzhou 215006
，

China
）




[Abstract] To investigate the effect of compound Chinese
traditional medicine PC-SPES
Ⅱ

I in inhibiting proliferation of
human prostate cancer cell LNCaP based on the androgen
receptor
（
AR
）

signaling pathway. The effect of PC-SPES
Ⅱ

on LNCaP cell proliferation was detected by MTT assay.
According to the findings
，

at the mass concentration of 180-1
440 mg?L^-1
，

PC-SPES
Ⅱ

significantly inhibited the proliferation of LNCaP cells; the
IC₅₀ of PC-SPES
Ⅱ

at 24 h and 48 h
were 311.48
，

199.01 mg?L^-1
，

respectively. The flow Cytometry detection showed 240
mg?L^-1 PC- SPES
Ⅱ

arrested cells in
G₂/M phase
，

and an obvious apoptotic
peak appeared before
G₀/G₁ peak
and rose over time. Meanwhile
，

Hoechst 33258 staining
revealed apoptotic cellular morphology. Annexin V-FITC/PI
staining manifested an increase in apoptotic cell ratio at the
PC- SPES
Ⅱ

concentration of 480
mg?L^-1 in a dose dependent manner.
The prostate specific antigen
（
PSA
）

secretion of LNCaP cells
was tested by PSA ELISA kit. Besides
，

compared with 25
mg?L^-1 Bic
，

480
mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ

significantly
reduced the cell secretion of PSA. The AR and PSA mRNA and
protein expressions were detected by qRT-PCR and Western blot.
According to the results
，

after the induction of LNCaP cells
with synthetic androgen 25
μ
g?L^-1
R1881
，

240-480 mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ

notably down-regulated the AR and PSA mRNA and protein
expressions and inhibited the translocation of AR from
cytoplasm to nucleus. In summary
，

PC-SPES
Ⅱ

significantly
can inhibit the in vitro proliferation of LNCaP cells and arrest
cell cycle arrest in G2/M phase. Its mechanism may be
associated with the down-regulation of the AR and PSA
expressions and the inhibition of AR nuclear translocation.




[Key words] prostate cancer; PC-SPES
Ⅱ
; LNCaP cell;
proliferation inhibition; androgen receptor; prostate-specific
antigen



doi
：
10.4268/cjcmm20150531



中药复方
PC-SPES
是由菊花、灵芝、甘草、大青叶、三
七、
冬凌草、
黄芩和棕榈子
8
味药组成，
除棕榈子产自美洲，
其 余
7
味药均来自中国
[1]
。
20
世纪
90
年代
PC- SPES
从中国
引入美国，
1996
年由
Botanic Lab< br>（
Brea
，
CA
）公司将其投
放市场。
1998< br>年
New Engl J Med
上首次报道了
PC- SPES
的
生物学活性和临床疗效，
表明
PC- SPES
可以显著降低前列腺
癌

（
PCa
）患者血清睾酮 和前列腺特异性抗原（
PSA
）
，体
内外均有显著的抗前列腺癌的活性
[2]
。
2004
年
J Clin Oncol
再次指出
PC-SPES
治疗前列腺癌有显著疗效，与己烯雌酚
（
DES
）
相比更易被患者接受。
PC-SPES
一度在美国成为PCa
替代疗法的代名词，但因其化学成分复杂，作用机制不明，
最终撤出了美国市场[3]
。




为探讨
PC- SPES
的药效物质基础及作用机制，
本研究以
PC-SPES
为母体，去除 了含植物源雌激素的美洲草药棕榈
子，
以剩余
7
味中药组方，
更名为
PC-SPES
Ⅱ
[4]
。
PC-SPES
Ⅱ以灵芝为 君药，配以黄芩、大青叶、冬凌草、菊花共为臣
药，三七为佐药，甘草调和诸药为佐使药，共奏补养气血 、
清热解毒、活血化瘀之功。前期体内药效学结果显示
PC-SPES
Ⅱ能显著抑制 激素非依赖性人前列腺癌细胞株
PC-3
裸鼠移植瘤的生长，降低血清
PSA
水平
[5]
。本实验在
前期研究基础上，考察
PC-SPES
Ⅱ对 激素依赖性人前列腺
癌细胞
LNCaP
抑制增殖的作用，以及对雄激素受体

（
AR
）

信号通路相关分子
mRNA
和蛋白表达 的影响，
以期进一步揭
示
PC-SPES
Ⅱ的作用机制。




1
材料




1.1
细胞

激素依赖性人前列腺癌
LNCaP
细胞购自中国
科学院上海细胞库。




1.2
药物与试剂

PC-SPES < br>Ⅱ（上海中耀生物科技有限
公司，棕褐色干膏粉，批号
20120530
），美曲勃龙（
R1881
）
（纯度≥
99%
，上海波以尔化工有 限公司，批号
20130602
）
，
比卡鲁胺（
Bic
）< br>（纯度≥
98%
，上海波以尔化工有限公司，
批号
20120825< br>）
。
RPMI-1640
培养基、胎牛血清（
FBS
）
（美
国
Hyclone
公司）
，胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（
EDT A
）
（国
药集团化学试剂有限公司）
，噻唑兰（
MTT
）< br>、二甲基亚砜
（
DMSO
）
（美国
Sigma
公司）
，
PI/RNase Staining Buffer
，
Annexin V-FITC
凋亡检测试剂盒（美国
BD
公司）
，
Hoechest
33258
（武汉谷歌生物科技有限公司）
，
Trizol
（
美国
Invitrogen
公司）
，
Oligo dT18
，
dNTP
（
10
mmol?L^-1
）
，
M-MLV
（
RNase H-
）
，
RNase Inhibitor
（日本
Takara
公司）
，
SYBR Green PCR MAster
Mix
（美国
Applied Biosyst ems
公司）
，细胞核蛋白与细胞浆
蛋白抽提试剂盒（上海威奥生物科技有限公司）< br>，
GAPDH
一
抗（杭州贤至生物科技有限公司）
，雄激素受体（AR
）一抗、
人前列腺特异性抗原
（
PSA
）
一抗（美国
CST
公司）
，
anti-Rabbit
IgG
二抗
（美国
LI-COR
公司）
，
人前列腺 特异性抗原
（
PSA
）
ELISA
检测试剂盒（上海西唐科技有限公 司）
。




1.3
仪器

CO₂
培养箱、
超低温冰
箱（美国
Thermo
公司）
，冷冻离心机（美国
Sigma
公司）
，
倒置荧光显微镜（日本
Olympus
公司）
，多功能酶标仪（美
国
Bio-tech
公司）
，
流式细胞仪
（美国
BD
公司）
，
PCR
仪
（美
国
Applied Biosys tems
公司）
，实时荧光定量
PCR
仪（德国
Qiagen
公司）
，电泳及转印装置（美国
Bio- Rad
公司）
，红外
激光成像系统（美国
LI- COR
公司）
。




2
方法




2.1
药液配制

称取
PC-SPES
Ⅱ干膏粉
3.6 g
，溶于
10
mL 70%
乙醇，配制成
360 g?L^-1
储备
液
;37
℃孵育
1 h
，低速离心取上清，用
0.22
μ
m
微孔滤膜
过滤
[6]
。

R1881
，
Bic
分别溶于无菌二甲基亚砜（
DMSO
）
中，配制成
2.5
，
100 g?L^-1
储备液，
-80
℃保存备用。




2.2
细胞培养

LNCaP
细胞常规培养，
RPMI-1640
培养
液，含
10%FBS
，青霉素
100 U?mL^-1
和链霉素
100 U?mL^-1
，置于
37
℃，< br>5%CO₂
的培养箱中，用
0.25 %
的胰酶
（含
0.02%EDTA
）消化传代，每
5
～6 d
传代
1
次。




2.3 MTT
法检测细胞活力

取对数生长期的
LNCaP
细胞
经胰酶消化后，

以
1
×
10⁴
个
/
孔细胞
传于
96
孔培养板，每孔
0.1 mL
。待细胞贴壁后， 阴性对照
组加入含
0.5%
乙醇的培养液，
实验组加入终质量浓度分别为180
，
360
，
720
，
1 440 mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ，每组
4
个复孔，其中含药培养液中的乙醇浓度均小于
0.5%
。分别于
37 ℃，
5%CO₂
培养箱
中培养
12
，
24
，
48
，
72 h
后，弃培养 上清，每孔加入不含
FBS
的
RPMI-1640
培养液
100
μ
L
，
MTT
（
5
g?L^-1
）
10
μ
L
，继续培养
4 h
后吸去
培养液，
每孔加
DMSO 150
μ
L
，
振荡
10 min
，
使蓝紫色甲
?H
结晶完全溶解，用多功能酶标仪在
490 nm
处检测吸光度
A
。
细胞活力
=
（
A<s ub>
实验组
</sub>-A_{空白组< br>}
）
/
（
A_{阴性对照组}-A<sub>
空白组
</ sub>
）×
100%
。





2.4
流式细胞仪检测细胞周期分布

取对数生长期的
LNCaP
细胞经胰酶消化后，

以
5×
10⁵
个
/
孔的细胞数接种于
6
孔板中，
每孔
2 mL
。
待细胞贴壁 后，
阴性
对照组加入含
0.1%
乙醇的培养液，
实验组加入终质量浓 度为
240 mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ，分别于
37
℃，
5%CO<sub>2</sub >
培养箱中培养
0
，
12
，
24
，
48 h
后，消化收集细胞，用预冷
PBS
洗
1
次，加入预冷
70%
乙醇固定细胞，
4
℃过夜。离心弃上清，用预冷
PBS
洗
1
次，
加入
0.5 mL PI/RNase Staining Buffer
，
室温孵育
15 min
。
使用流式细胞仪检测细胞周期分布。




2.5 Hoechst 33258
染色观察凋亡细胞形态

取对数生长
期的
LNCaP
细胞经胰酶消化后，

以
1
×
10⁵
个
/
孔的细胞数接种于
24
孔板中，
每孔
1 mL
。待细胞贴壁后，阴 性对照组加入含
0.1%
乙醇的
培养液，实验组加入终质量浓度为
480
mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ，分别于
37
℃，
5%CO<sub>2</sub >
培养箱中培养
0
，
12
，
24
，
48 h
后，
弃培养上清，
用预冷
PBS
洗
1
次，
加入预冷
95%
乙醇固
定细胞，
4
℃过夜。弃固定液，用 预冷
PBS
洗
2
次，加入
Hoechst 33258
，
37
℃染色
15 min
，用预冷
PBS< br>洗
2
次，于
倒置荧光显微镜下观察拍照。




2.6 Annexin V-FITC/PI
双染流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期的
LNCaP
细胞经胰酶消化后，

以
5×
10⁵
个
/
孔的细 胞数接种于
6
孔板中，
每孔
2 mL
。待细胞贴壁后，阴性对照组加 入含
0.1%
乙醇的
培养液，实验组加入终质量浓度为
480
mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ，分别于
37
℃，
5%CO<sub>2</sub >
培养箱中培养
0
，
24
，
48 h
后，< br>胰酶（不含
EDTA
）消化收集细胞，用预冷
PBS
洗
2次，重
悬细胞于
Binding buffer
中，按照试剂盒说明加入
Annexin
V-FITC
和
PI
各
5
μ
L
，室温孵育
15 min
。使用流式细胞仪
检测细胞凋亡率，其中
Annexin V
阳性，
PI
阴性代表早期凋
亡细胞，
Annexin V
阳性，
PI
阳性代表晚期凋亡细胞。




2.7 ELISA
法测定细胞分泌
PSA
水平

取对数生长期的
LNCaP
细胞经胰酶消化后，

分别以
1
×
10⁵
个
/
孔 细胞传于
24
孔板中，每孔
1
mL
。
待细胞贴壁后，阴性对照组加入含
0.1%
乙醇的培养液，
阳性对照组加入终质量浓度为
25
mg?L^-1Bic
，实验组加入终 质量浓度
为
480 mg?L^-1PC- SPES
Ⅱ，培养
0
，
12
，
24
，
48 h后，分别收集每孔细胞培养上清，按照人前列
腺特异性抗原
ELISA
试剂盒说明 操作，
多功能酶标仪在
450
nm
处检测吸光度
A
。




2.8 qRT-PCR
检测细胞
AR
，
PSA mRNA
的表达

取对数
生长期的
LNCaP
细胞经胰酶消化后，

以
5
×
10⁵
个
/
孔的细胞数接种于
6
孔板中，
每孔
2 mL
。待细胞贴壁后，阴性 对照组加入含
0.1%
乙醇的
培养液，实验组均加入终质量浓度
25
μ
g?L^-1R1881
，分别加入终质 量浓度为
240
，
480 mg?L^-1 PC-SPES
Ⅱ或
25
mg?L^-1 Bic
，于
2%FBS RPMI-1640
中培养
24 h
后，消 化收集细胞。按照
Trizol
试剂说明提取细
胞总
RNA
，所提取 的
RNA
用
NanoDrop 2000
（美国
Thermo
公司）测定浓度，并根据
A₂₆₀/A<s ub>280</sub>
（
1.8
～
2.0
）
确定总
RNA
提取的纯度。
根据
RNA
浓度取
1
μ
g RNA
逆转录，
合成
cDNA
，
所得逆转录 产物用于
PCR
扩增。
通过
Primer- Blast
和
Primer Premier 5.0
设计引物，引物序列
及 扩增产物长度见表
1
，
引物由上海生工合成。
qPCR
反应条
件为
95
℃预变性
10 s;95
℃变性
15 s
，
60
℃退火
60 s
，
72
℃
延伸
30 s
，
40
个循环。
β
-ac tin
作为内参基因，目的基因的
相对表达量根据
2^-
Δ
Δ
CT
计算，
同时
参考溶解曲线确保 扩增产物的特异性。




2.9 Western blot
检测
AR
，
PSA
蛋白的表达

取对数生 长
期的
LNCaP
细胞，分组及加药同
2.8
项，于
2%F BS
RPMI-1640
中培养
24 h
后，刮刀刮下细胞，预冷
PBS
洗
1
次，
加含
1%PMSF
的裂解液充分裂解细胞，
提取细胞总蛋白，
或按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明分别提取
细胞浆蛋白 和核蛋白，
4
℃，
12 000
×
g
离心
15 min
，转移
上清。
BCA
法测定蛋白浓度，调整样品至相同浓度，与
5
×