HPV疫苗的制备-马小艮

2021年1月26日发(作者：管庭芬)
HPV
疫苗的制备及作用效果





HPV
是一类能够感染皮肤和粘膜的

DNA
病毒。高危型

HPV
是宫颈癌以及癌前病变
的要致 病因子，
99.7%
的宫颈癌组织都检测出高危型

HPV
。

针对

HPV
感染，
人类自 身所产生的免疫应答主要分为体液免疫和细胞免疫。
体液免疫
主要表现为

HPV
刺激机体

B
细胞产生抗

HPV
L1
、
L2
蛋白的抗体，但是由于产生抗体
的量特别少，
所以很难检测到这些特异性抗体，
阻碍了人们对体液免疫的相关研究。
细胞免
疫主要表 现为

T
细胞受

HPV
刺激后通过释放淋巴因子来杀死感染病毒的细胞
[1, 2]
。

目前预防和治疗

HPV
相关癌症最有效的方法是研制其特异性的

HPV
疫苗，
诱导机体
产生中和抗体，
激发保护性免疫反应，
以达到预防

HPV
相关癌症发生和传播的目的，
既可
以降低宫颈癌的发病率，也可降低与

HPV
感染有关的其它癌症的发病率。

人类乳头瘤病毒（
HPV
）是一种无包膜的双链闭环小分子
DNA
病毒，属乳头多瘤空病毒
科乳头瘤病毒属。
其基因约
8kb
，

只有
1
条
DNA
链可作为转录模板，
含
8
个开放阅读框
（
open
reading
frames
，
ORFs
）
，

分
3
个基因区，即早期区
(
early
region
，
E
区
)
、晚期区（
late
region
，
L
区）

与非编码区（
uncoding region
，
UCR
）

或上游调控区（
URR
）
。
E
区编码
E1
，
E2
，
E4
，
E5
，
E6
，
E7
等早期蛋白，参与病毒
DNA
的复制、转录、翻译调控和转化等功
能；
L
区编码主要衣壳蛋白
L1
和次要衣壳蛋白
L2
；
UCR
区含有
HPV
基因组复制起点和
HPV
表达所必需的调控元件。由ＨＰＶ产生的两种癌蛋白是Ｅ< br>6
和Ｅ
7
，可以抑制细胞周期负调
节因子的活性，
并可以在肿 瘤细胞中高度表达。
而晚期基因则编码衣壳的结构蛋白，
其中主
要衣壳蛋白Ｌ
1
结构保守，是ＨＰＶ衣壳的主要成分，约占衣壳蛋白的
80%
以上，因此成为
理想的预防免疫靶位。
基于
HPV
的致病机制和天然的免疫原性，
HPV< br>疫苗研究聚焦于
L1
、
E2
、
E5
、
E6
和
E7
。

目前
HPV
的疫苗主要分为预防性疫苗 和治疗性疫苗。
预防性疫苗主要诱导机体体液免疫
反应，
产生的中和性抗体在
HPV
进入机体前即能与病毒的抗原结合，
从而防止
HPV
的感染。
治疗性疫苗主要引起机体的细胞免疫反应，产生的活化效应性
T
细胞能识别和攻击
HPV
感
染的细胞，其中也包括
HPV
引起的恶性肿瘤细胞。

（一）
HPV
预防性疫苗

1.
预防性疫苗的制备依据及过程

预防性疫苗一般以
HPV
主要衣壳蛋白
L1
和次要衣壳蛋白
L2
为靶抗原
[3],
其作用在于
诱发肌体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应
,
以阻止
HPV
的长期感染和再感
染。
HPV
的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时
,
能自我装配或形成病毒样颗粒
(virus-like particles, VLPs)
,
其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，
将其置入机体后
可刺激产生中和抗体

IgG
和

IgA[4]
，达到预防相应型别
HPV
的感染，而且不包括病毒

DNA
，安全性好，能有效地保护人类和动物免受乳头瘤病毒的感染以及产生相关肿瘤的可能性
[5,6]
。
VLPs
颗粒直径为
50-55nm
，分子量为
55-60kDa
，
VLPs
是由纯化的
L1
蛋白装配
形成
HPV
的空衣壳。
VLPs
的最小结构单元是

L1
蛋白单体，
L1
蛋白主要是由

8
条反向
平行的
β
折叠肽链段构 成的，它们之间是由无规则的环形区（
loop
）连接在一起的，每个环
形区大约有< br>
10~30
个氨基酸（
aa
）
，这些区域绝大部分延伸到 五聚体和病毒颗粒的外表面，
是抗原表位的所在区域
[7-9]
；
不同型别< br>
HPV
环形区的序列和空间结构是不同的，
所以

HPV
具有高度的型别特异性。因此，目前对于

HPV
抗原表位的研究主要集中在

L1
蛋白的环
形区上
[10]
。


国内外有多家机构 在进行
HPV
疫苗的研究及其制备，大部分都是以
L1
和（或）
L2
蛋白为靶标进行制备的（单独表达
L1
或者联合表达
L1+L2
，获 得病毒样颗粒
(VLP)
）
。一般
步骤都是针对
HPV L1
和（或）
L2
蛋白的核酸序列为基础，对其进行改造优化（例如密码
子优化，
删除部分序列，
替换某个
/
些碱基，
连接其他基因等）
，
扩增或者合成优化后的序列，
然后将其克隆到表达载体上，
并在原核系统
（例如大肠杆 菌）
或者真核系统
（例如昆虫细胞，
酵母，
哺乳动物细胞等）
进行表 达，
再将表达的单个蛋白或者融合蛋白分离纯化，
添加佐剂
后制成疫苗，
通过 将制成的疫苗免疫小鼠或者其他动物对其免疫原性进行评价，
效果较好的
进行临床实验。

2.
已经被批准上市的预防性疫苗

目
前
已
经
被
批
准
上
市
的
预
防
性
H PV
疫
苗
有
两
种
，
它
们
分
别
是
英
国
葛
兰
素
（
GlaxoSmit hKline
，
GSK
）公司的双价疫苗“
Cervarix
”和美 国默克（
Merck & Co., Inc.
）公
司生产的四价疫苗“
Ga rdasil
”
（商品名）
[11]
。随着这两种疫苗的上市，人们对宫颈癌 疫苗
的研究主要集中在

HPV VLPs
疫苗上。
2006 < br>年，
“
Gardasil
”被批准上市，这是第一个商品
化的宫颈癌预 防性疫苗，它是由两个高危型
HPV16
、
18
和两个低危型

HPV6
、
11
的

L1-VLPs
组成的重组混合型疫苗，它们使用酿酒酵母体系产生

VLPs
，佐剂为氢氧 化铝
（
225ug
）
。
2007
年，英国葛兰素公司的“
Cervarix
”
（商品名）疫苗上市
[12
，它是

HPV16
、
18
的

L1-VLPs
组成的 重组混合型疫苗，利用重组杆状病毒感染的昆虫细胞
(
粉纹夜蛾）产
生
VLP s
，佐剂为传统铝盐（
500ug
）加上
AS04(50ug)[13, < br>14]
。这两种疫苗都是预防性的，
不是治疗性的，主要接种于未发生
HPV< br>感染的人群，用来预防

HPV
感染以及相关疾病的
发生。这两种疫苗 的抗原都是
HPV
主要衣壳蛋白的
L1
。临床试验结果证明，上述疫苗均具< br>有良好的耐受性，
且没有严重的不良反应，
抗体效价比自然感染
HPV
的患者高
50
倍。
此外，
最近
Merck
公司又研发出了< br>Gardasil
九价预防性疫苗（
HPV6/11/16/18/31/33/45/ 52/58
）
。
Gardasil
已在
117
个国家或 地区被批准使用，全球
33
个国家多中心的联合试验结果表明，
疫苗对宫颈癌、癌前病 变以及其他生殖道疾病的预防作用可达
99%
～
100%
；
Cervarix
疫苗
对
HPV16
和
HPV18
所致
CIN
Ⅱ、Ⅲ的保护效力达到
100 %
；
Merck
公司的九价疫苗已经
于
2015
年进入三期 临床试验。二价疫苗针对
HPV16
、
18
产生的保护性抗体均可维持
100%
的血清阳性至少
8.4
年
[15]
；四价疫苗针对
HPV16
产生的保护性抗体能维持< br>98.8%
的血清
阳性至少
5
年
[]16]
。

3.
其他处于研究阶段的预防性疫苗（部分）






Xie
等
[17]
在杆状病毒昆虫细胞中表达纯化了

HPV 16,18,58 LI VLPs
，对各型
VLPs
进
行 了纯度、形态学及免疫原性的研究，特别是
HPV58L1
VLPs
诱发长期中和抗 体活性及协
同
A1(0H)
3
佐剂的相关研究。
在此基础上，
表达及纯化了以
HPV16L1 VLPs
为载体的嵌合各
种
HPV 16

L2
保守表位的杂合蛋白，并对影响杂合
L1
组装能力及其诱发中 和抗体活性的
因素进行了研究。
HPV LI VLPs
免疫小鼠测定
ED50
，将
HPV 16,18,58 LI VL Ps
单独或混合
免疫小鼠诱发了较高滴度的针对组成型别的中和抗体，
表明
H PV16,18,58 LI VLPs
免疫原性
很强。

韩国的金洪珍等< br>[18]
通过优化
16
型和
18
型的
HPV
序列，构建至
pUCminvsMCS
载体
及
YEG-MCS
酵母表 达载体，
以酿酒酵母为宿主菌进行表达，
通过肝素层析和阳离子交换层
析进行表达蛋白 的纯化并进行浓缩。
纯化得到的蛋白添加佐剂后免疫小鼠，
发现组合佐剂增
加了免疫刺 激效果，总
IgG
效价增高。该药物疫苗组合物可比常规疫苗
(
包括
CervarixTM
及
GardasilTM)
诱导更强的针对
HPV
的免疫应答，
因而具有优良的宫颈癌预防功效。此外，
该药物疫苗组合物由于用作免疫佐剂的脱酰基化的非毒性
LOS
几乎无细胞毒性而具有优良
安全性。
该药物疫苗组合物比施用

CervarixTM
及
GardasilTM
显著提高与
Th1
型免疫应答
(
细胞免疫
)
相关的干扰素
-
γ
、
IgG2a
及
IgG2b
水平，
以及与
Th2
型免疫应答
(
体液免疫
)
相关的
IgG1
水平。总体来说，本药物疫苗组合物可诱导均优于
CervarixTM
及
GardasilTM
的针对
HPV
的
Th1
型免疫应答
(
细胞免疫
)
及
Th2
型免疫应答
(
体液免疫
)
。

厦门大学的李少伟等
[19]
对全长
HPV31L1
基因依照大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化