抗菌抗病毒常用实验研究方法

2021年1月24日发(作者：贝多广)
抗菌抗病毒常用实验研究方法

细菌、
病毒性疾病是目前国内外流行的主要传 染病
,
尤其是近两年来
,
由冠状
病毒引起的
SARS
及由流感病毒引起的禽流感给动物及人类带来的严重危害
,
是
人所共知的
< br>由于各种疫苗的不断出现
,
虽然一些细菌、
病毒病已得到了有效的控
制
,
但是其治疗尚无有效的解决方法因此研制高效、低毒的新型中药抗菌、抗病
毒制剂已 成为巫待解决的问题。

1
、常用的抗菌方法

1
、
1
稀释法

1
、
1
、
1
试管稀释法

培养基内抗生素 的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌，
经孵育后，
观察
能引起抑菌作用最低抗生素 浓度，
称最低抑菌浓度
(MIC)
为该菌对药物的敏感度。
稀释法所获得的结 果比较准确，
常被用作校正其他方法的标准。
如以下黄贝贝等
的青钱柳抗菌作用的实验 研究和黄利权等的火绒草的抗菌活性研究的实验方法
:
1
、应用试管稀释法
,
测定青钱柳提取物对试验菌的抑菌效果
,
检验不同浓度
下青钱柳提取物对细 菌、霉菌的抗菌作用。结果
:
青钱柳提取物在体外对金黄色
葡萄球菌、乙型溶血性链球 菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用
;
而对大肠埃
希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴 性菌的抗菌作用不明显
;
对黄曲霉、烟曲霉等
霉菌的抗菌作用不明显
[1]< br>。

2
、采用试管稀释法
,
分别测定了火绒草水煎液、水提醇 沉液、醇提物、醇提
石油醚部分、
醇提乙酸乙酯部分、
醇提正丁醇部分、
醇提 水溶部分等
7
种提取物
对大肠杆菌
C83882
、大肠杆菌
C83903
、大肠杆菌
C83914
、沙门氏菌
C79-20
、金
黄色葡萄球菌
Newbould S-305
、金黄色葡萄球菌临床分离株等
6
株病原菌的最
低抑菌浓度
(MIC)
和最低杀菌浓度
(MBC)< br>。试验结果表明
,
火绒草醇提物及其石油
醚部分和乙酸乙酯部分对两种金黄色葡 萄球菌具有较强的抑制作用
,
其
MIC
为
0114 mg/ml
生药浓度
,MBC
为
0127 mg/ml
生药浓度,
而其它部分对金黄色葡萄球
菌的抑制作用较弱。
火绒草醇提正丁醇部分和水溶部 分对
3
株大肠杆菌和
1
株沙
门氏菌具有较强的抑制作用
,< br>其
MIC
为
2170 mg/ml
生药浓度
,MBC
为
2170 mg/ml
生药浓度
,
显示了较强的抗菌活性
[2]
。

1
、
1
、
2
肉汤稀释法

以水解酪蛋白< br>(M-H)
液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待检
细菌，定量测定抗菌药 物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度
(MIC)
或最低杀菌浓度
(MBC)
。< br>
如刘菁菁的研究蓝玉簪龙胆对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
( MRSA)
的 体内
外抗菌活性。蓝玉簪龙胆分别以乙醇、氯仿、正丁醇、蒸馏水提取，得到极性不
同的
4
部分产物，
利用肉汤稀释法测定其对
MRSA
和甲氧西林敏感金黄色葡萄球
菌
( MSSA)
的最低抑菌浓度
( MIC)
体内实验部分
:
采用腹腔注射
MRSA
法建< br>立小鼠感染模型，
分别给予蓝玉簪龙胆水提液高、
中、
低剂量，
银黄胶 囊治疗
15
d
，并与模型对照组比较，观察存活率。结果：体外实验
:
蓝玉簪龙胆各极性组
分对
MRSA
和
MSSA
菌株 均有不同程度的抑菌作用，
其中正丁醇组分抑菌作用最
强，
其次为乙醇、
水层 组分
;
体内试验
:
除了蓝玉簪龙胆大剂量组，
其余各治疗
组存活率均高于模型对照组，而蓝玉簪龙胆中剂量组存活率最高。结论

蓝玉簪
龙胆对
MRSA
和
MSSA
均具有一定的抗菌作用，而且敏感性差异无显著性
;
对

MRSA
感染小鼠有一定治疗作用
[3]
。胡景玉等为了了解衡水地区大肠埃希菌的药
敏情况，采用肉汤稀释法
18
种抗菌药物最低抑菌浓度（
MIC
）并计算其< br>MIC
50
和
MIC
90
。结果亚胺培南、哌拉西林、他唑巴 坦和头孢哌酮、舒巴坦显示良好的抗菌
作用，其
MIC
50
分别为
0 .5
μ
g/ml
、
1
μ
g/
ml
、
0.5
μ
g/
ml
；
MIC
90
均为
2
μ
g/ml< br>，
其他药物显示不同程度的耐药，
且大肠埃希菌产
ESBLs
的检出率 较高。
结论检出
的大肠埃希菌存在多重耐药，仅对亚胺培南、哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、
舒巴坦普遍敏感
[4]
。
Kianbakht S
等通过肉汤稀释法 研究刺蒺藜不同部位（果、
茎叶、根）的甲醇提取物对金黄色葡萄球菌
ATCC
29213
、粪肠球菌
ATCC
29212
、
肠埃希氏菌
ATCC 25922
、绿脓杆菌
ATCC 27853
四种细菌的抗菌能力，研究结果
表明：果、茎叶对四种菌的
MIC
值均为
2mg/ml
；根的甲醇提取物对< br>MIC
值对金
黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肠埃希氏菌均为
4mg/ml
，对绿脓杆菌的
MIC
值为
2mg/ml
[5]
。

1
、
1
、
3
琼脂平板稀释法


将不同浓度的抗菌药物，分别加入到定量的琼脂培养基中，混匀，制成固
体含药平皿，
使每一个 平皿中所含抗菌药物的浓度相差
2
倍，
用多点接种仪把待
测细菌点种到含有抗 菌药物的琼脂培养基的表面上，
在特定温度下培养适当时间
后，平皿上无菌落生长的最低药物浓 度为抗菌药物对受试菌种的最低抑菌浓度。
每一次实验都应用标准菌株做质控。
琼脂平板稀释法 本法的特点是可同时进行大
量菌株的药敏测定。也适用于中草药和厌氧菌的药敏测定。
如汪黎虹等应用超微粉碎法将虎杖、石榴皮、马齿苋、苦楝皮、大黄等
10
种中药进行加工 处理至粒径为
5~10
μ
m
后，
利用琼脂稀释法测定其实验室近年来
收集的患病鳗鲡中分离得到的
18
株常见致病菌的抑菌作用。
结果表明
:
上述
10
种中药单用对除
B12
肺炎克雷伯菌以外的
17
株养殖鳗鲡主要致病菌均有一定的
抑制作用，其平均抑菌浓度
( MIC)
范围为
0. 165~128 mg /mL
，平均杀菌浓度
(MBC)
范围为
0. 210~128 mg /mL
[6]
。

1
、
1
、
4
浓度梯度法


浓度 梯度试验是一种定量的抗生素药敏测定技术，可用于非苛养革兰阳性
和阴性需氧菌
(
如 肠杆菌、
假单胞菌、
葡萄球菌和肠球菌
)
以及苛养菌
(
如厌 氧菌、
肺炎链球菌和嗜血杆菌
)
的药敏测定。该系统包含有一个预先制备好的抗生素浓
度梯度，可用于在琼脂培养基判断某抗生素对微生物的最小抑菌浓度
(MIC)
。如< br>刘芳等的武汉地区住院患儿感染肺炎链球菌的耐药状况。

如刘芳等的收集医院
2009
年
1-12
月住院患儿分离的肺炎链球菌
1521
株
,
采
用纸片扩散法及
E-test
法进行抗菌药物敏感试验
;< br>按
CLSI 2008
年版判断结果；
使用
X
2
检 验分析耐药性的变化。
研究结论为武汉地区住院患儿分离的肺炎链球菌
对红霉素、
克林 霉素、
四环素及磺胺甲噁唑、
甲氧苄啶的敏感率极低
,
对左氧氟
沙星及万古霉素均有极高的敏感率
,
对青霉素仍保持较高的敏感率
,
可作为治
疗普通肺炎链球菌感染的首选药物
[7]
。

1
、
1
、
5
试管两倍稀释法

试管两倍 稀释法取生长浊度达
9×10
8
mg/ml
菌液，菌液用培养液稀释，接种< br>于无菌试管中，
然后加入不同浓度的抗菌药物或未知药物，
37
℃孵育。
16
～
24
h
，
以无细菌生长的最低浓度为
MIC。
将无细菌生长的完全清晰液再移种于不含抗菌
药物的血平板中，经
37
℃过夜培养，菌落数不超
5
个的平板的最低药物浓度即
为该药物的
MBC。一般以
MIC
来评价细菌对药物的敏感度。

马加庆等的采用试管两倍 稀释法观测利胆止痛胶囊在体外对甲型溶血性链
球菌、
乙型溶血性链球菌、
金黄色葡萄 球菌及痢疾杆菌、
大肠杆菌和沙门菌生长
的影响．研究结果表明：利胆止痛胶囊对金黄色葡萄球 菌、甲型溶血性链球菌、
乙型溶血性链球菌、
痢疾杆菌和大肠杆菌的
MIC
分别为
25
、
50
、
50
、
25
和
12.5
mg/mL
，对沙门菌无明显抑菌作用
[8]
。

1
、
1
、
6
微量肉汤稀释法

微量肉汤稀 释法的原理：
原理同肉汤稀释法。
石功名等的对西他沙星与莫西
沙星抑制细胞内外金黄 色葡萄球菌
ATCC25923
的活性进行体内外研究，采用微量
肉汤稀释法检测药物 的
MIC
，
MBC
及
MPC
，
研究结果表明：在体外实验中，
MIC
，
MBC
，
MPC
及时间与浓度 杀菌曲线实验表明西他沙星胞内外抑菌活性均强于莫西沙星
[9]
。

1
、
1
、
7
微量稀释法

微量稀释法本法 为改进的试管稀释法。取稀释菌液接种在
96
孔板中，然后
加入待试抗菌药物，混匀后 放置
37
℃孵育
16
～
24 h
，在衬有黑底板的光线下观
察，
细菌生长时小孔呈弥散状混浊或在孔底部有圆形或丝状的沉淀；
无细菌生长
时孔内所含最低抗菌药物浓度即为
MIC
。
把无细菌生长孔内液体移种不含抗菌药< br>物血平板中，菌落数少
5
个的平板的最低药物浓度即为
MBC
。

如宋晓晶等通过微量稀释法分别测定特比萘芬、
氟康唑、
伊曲康唑、
制霉 菌
素对
38
株临床分离的口腔念珠菌的体外敏感性。研究结果表明：
38株白念珠菌
对氟康唑耐药
4
株
,
敏感
34
株
;
对伊曲康唑耐药
5
株
,
敏感
33
株
;
对特比奈芬
耐药
15
株
,
敏感
23
株
;
制霉菌素均敏感
[10]
。

1
、
2
纸片琼脂扩散法

琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种 试验菌的平板表面，
抗菌药物在琼脂胶内
向四周自由扩散，
其浓度随扩散距离增大而降 低，
在药物一定的扩散距离内，
由
于药物的抗菌效应，
试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，
抑菌圈的
大小与药物的抑菌效应成正比。

如熊枫等的从西太平洋近赤道区采集到的
18
个深海沉积物样品中分离到
83
株海洋真菌
,
采用滤纸片琼脂扩散法和
MTT
法分别对其发酵液乙酸乙酯抽 提物的
抗菌、抗肿瘤活性进行筛选
.
结果显示
,
有
37株菌株对至少一种指示菌有抑制作
用
;
有
29
株菌株对
KB
或
Raji
肿瘤细胞具有显著的抑制活性
,
分别占总供测菌株< br>的
44.6%
和
34.9%.
在抗肿瘤活性菌株中
,WP-M -1
、
DY-G-2
、
DY-C-2
、
WP-K-3
和
WP-Q-2
等
5
株菌具有很高的活性
,
其发酵液乙酸 乙酯抽提物对
Raji
细胞的
IC50
分别为
5.000
、
1.064
、
2.796
、
1.920
、
0.52 0Lg/mL.
研究结果表明
,
海洋沉积物
来源的真菌中蕴藏着丰富的抗菌及 抗肿瘤活性代谢产物产生菌
,
是开发抗菌和抗
肿瘤药物的宝贵资源
[11]< br>。
又如邬晓勇等的建立了蛙皮抗菌肽的活性测定方法——
—
TTC
微量稀释法
;
利用
SephadexG25
凝胶层析分离抗菌肽粗品获得一个活性
组分命名为
G5
，利用
TTC
微量稀释法测定活性组分
G5
抑制大肠杆菌的
MIC
是
80
μ
g/mL
、
抑制铜绿假单胞菌的
MIC
是
20
μ
g/mL
、
抑制金黄色葡萄球菌的

MIC
是
80
μ
g/mL;
活性组分
G5
再经凝胶
HPLC
分离纯化获得两个活性组分
Ⅰ和Ⅱ，组分Ⅰ和组分Ⅱ再分别经过
RP-HPLC
分离纯化获得两个色谱纯的活性
组分命名为
Rana
Ⅰ和
Rana
Ⅱ
[12]
。

1
、
3
平板稀释法

如吴决等的探讨抗菌性中药药物敏 感试验在鉴定中药新药上的应用。
应用中
药药敏试验平板稀释法鉴定中药新药
/
万力通
0
对常见十余种细菌的最低抑菌浓
度
(MIC).
结果
运用平板稀释法测定中药新药
MIC,
效果理想
.
结论
< br>在中药药敏
试验诸方法中
,
平板稀释法鉴定中药新药抑菌作用
,
方法简便
,
易操作
,
结果易观