(完整版)免疫沉淀法原理及操作

2021年1月23日发(作者：戴路)

免疫沉淀法是一种将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性研究蛋
白质间交互作用的生物技术。
这项技术可以从含有不同蛋白质的样品中，
分离和浓缩出特定蛋白质，即纯化蛋白质，比如沈涛等在研究骨肉瘤细胞中
ArgBP2
的表达和定位中就用 到这
项技术来纯化
ArgBP2
蛋白。

其原理是在细胞裂解液中加 入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结
合于
sepharose beads
上的
proteinA/G
，与细胞中有目的蛋白结合，就形成一种免疫复合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。

免 疫沉淀的操作过程主要分三个阶段：第一步是制备抗原溶液，任何抗原溶液均可作
为免疫沉淀的材料来源 ，
一般采用细胞或组织制备的裂解物；
第二阶段是对裂解物进行预处
理，
免疫 沉淀要求抗原的纯度尽可能高，
用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，
可以
从抗 原溶液中除去非特异性结合蛋白；
最后阶段是免疫复合物的形成与纯化，
即在预处理过
后的裂解物中加入特异性抗体形成免疫复合物，然后将免疫复合物经蛋白
A
或蛋白
G< br>结合
的琼脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基质进行纯化。
蛋白
A
和蛋白< br>G
对抗体的
Fc
段有较高的
亲和力。蛋白
A/G
与抗 体结合后，通过洗涤微珠即可除去未结合的蛋白，剩下与基质结合
的即是纯化的抗原抗体复合物。

具体步骤可以如下进行：

（
1
）收获细胞，加入适量细胞IP
裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）
，冰上或者
4
℃裂解
30m in, 12,000r/min
离心
30 min
后取上清；



（
2
）

取少量裂解液以备
Western < br>blot
分析，剩余裂解液将
1μg
相应的抗体和
10-
50
μl
protein A/G-beads
加入到细胞裂解液，
4°
C
缓慢摇晃孵育过夜；



（
3
）免疫沉淀反应后，在
4°
C
以
3,000 r/min
速度离心
5 min,
将
protein A/G-beads
离心
至管底；将上清小心吸去，
protein A/G-bea ds
用
1ml
裂解缓冲液洗
3-4
次；最后加入
15μl< br>的
2×
SDS
加样缓冲液，沸水煮
10
分钟；



（
4
）
SDS-PAGE, Western blotting
或进行质谱分析。

免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，
为
SDS-PAGE
和
MS
质谱分析鉴定准
备样品。如贺莉等在筛选肿瘤血管靶向肽
CGNSNPKSC< br>的结合受体时就用了这个方法：先
利用天然膜蛋白提取试剂盒提取人脐静脉内皮细胞的膜蛋白，< br>然后将提取的膜蛋白与亲和素
标记的磁珠在
4°
C
孵育
2h
，除去与亲和素结合的蛋白。利用磁力架，将上清液转移到
EP
管中，弃去磁珠 。生物素标记的无关对照肽和亲和素标记的磁珠孵育，形成对照肽
-
磁珠复
合物，然后 该复合物与上述的上清液在
4°
C
孵育过夜，除去与生物素及二硫键等结合的膜