酶联免疫吸附试验(ELISA)基本原理与结果解释

2021年1月23日发(作者：梅镇岳)
酶联免疫吸附试验（
ELISA
）

基本原理与结果解释

基本原理：

一、包被

1
、固相载体的要求

（
1
）
、结合抗体或抗原的容量大


（
2
）
、抗体或抗原牢固地固定在其表面


（
3
）
、不影响免疫反应性


（
4
）
、利于反应充分进行


（
5
）
、固相方法简便易行，快速经济

2
、固相载体的材料：聚笨乙烯













3
、包被
coating
将抗原或抗体结合于固相载体。

4
、封闭
blocking
用
1%
～
5%
的牛血清白蛋白或
5%
～
20%
小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，
消除
非特异性吸附。

二、反应

加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。

标记酶的要求：

(1)
、活性高

(2)
、性质稳定

(3)
、专一性强

(4)
、酶催化底物的显色信号易于判断和测量

(5)
、方法敏感，重复性好，简单易行

(6)
、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉



常用酶

辣根过氧化物酶
HRP
（
ELISA
中应 用最为广泛的标记用酶）

三、洗涤

使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。

四、底物显色














HRP
DH2+H2O2
—————→

D+2H2O

H2O2
为受氢体，
HRP
对受氢体的专 一性很高。供氢体
DH2
习惯上被称为底物，底物有多
种。

常用底物：四甲基联苯胺
TMB
四甲基联苯胺
TMB
是
E LISA
中应用最广泛的底物。
TMB
反应后显蓝色

，
加酸终止反应后
变为黄色
,
测定波长
450nm
，稳定，无致癌性。


常用方法与原理

一、双抗体夹心法

方法：

用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色

应用：





二价或二价以上的较大分子抗原测定




乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、
HCG
等

二、双抗原夹心法

原理：类似双抗体夹心法

操作步骤：类似双抗体夹心法

应用：乙型肝炎表面抗体



三、竞争法（测抗原）

方法：

用已知抗体包被，加入待测血清，
再加酶标抗原，
酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。
加底物显色 。

应用：

用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）

四、竞争法（测抗体）

原理：类似检测抗原的竞争法

应用：乙型 肝炎病毒核心抗体
(HBcAb)
和乙型肝炎病毒
e
抗体
(HBeA b)
的检测




五、间接法

方法：





用已知抗原包被，加入待测血清 ，再加酶标的抗人
IgG
（抗抗体或二抗）加底物显色。

优点：




一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

应用：





常用于
HCV
抗体、
HIV
抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定。