(完整版)ELISA原理和分类(附图解)

2021年1月23日发(作者：司马光)

一、
ELISA
的原理

ELISA
的基础是抗 原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗
原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，
又保留酶的活性。
在测定时，
受检标本
（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗
涤的方法使固相 载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗
原或抗体，
也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一
定的比例。加入酶反应的底物后，
底物被酶催化成为有色产物，
产物的量与标本中受检物质
的 量直接相关，
故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，
间接 地
放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

二、
ELISA
的类型

ELISA
可用于测定抗原，也可 用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：

（
1
）固相的抗原或 抗体，即

免疫吸附剂

（
immunosorbent
）；

（
2
）酶标记的抗原或抗体，称为
“
酶联物
”
、
“
结合物
”
（
conjugate
）
；

（
3
）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条 件，可设计出各种不
同类型的检测方法。用于临床检验的
ELISA
主要有以下几种类 型：

（一）

双抗体夹心法测抗原



双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（
1
）

将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（
2
）

加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形 成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。

（
3
）

加酶标抗体，保温反应。
固相免疫复合物上的抗原 与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合
的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的 量相关。

（
4
）

加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。

在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如
HBsAg
、
HBeA g
、
AFP
、
hCG
等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体 ，
就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清，
包被和 酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。
如应用单克隆
抗体，
一般选择两个针对抗 原上不同决定簇的单抗，
分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
这种双位点夹心法具有很高的 特异性，
而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，
作一
步法检测。
< br>在一步法测定中，
当标本中受检抗原的含量很高时，
过量抗原分别和固相抗体及酶标抗< br>体结合，而不再形成

夹心复合物

。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现 象，此时反应后显

色的吸光值
（位于抗原过剩带上）与标准曲线
（位于抗体 过剩带上）某一抗原浓度的吸光值
相同，
如按常法测读，
所得结果将低于实际的含量，
这种现象被称为钩状效应
（
hook effect
）
，
因 为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。
钩状效应严重时，
反应甚至可不显色而出现假阴性结
果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中
HBsAg
、AFP
和
尿液
hCG
等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单 克隆抗体制备此类试剂可削
弱钩状效应。

假使在被测分子的不同位点上含有多个相同 的决定簇，例如
HBsAg
的
a
决定簇，也可
用针对此决定的同一单 抗分别包被固相和制备酶结合物。但在
HBsAg
的检测中应注意亚型
问题，
HBsAg
有
adr
、
adw
、
ayr
、
ayw4
个亚型，
显然每种亚型均有相同的
a
决定簇的反应性，
这也 是用单抗作夹心法应注意的问题。

双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（
RF
）的干扰。
RF
是一种自身抗体，
多为
IgM
型，能和 多种动物
IgG
的
Fc
段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有< br>RF
，
它可充当抗原成份，
同时与固相抗体和酶标抗体结合，
表现出假 阳性反应。
采用
F
（
ab'
）
或
Fab
片 段作酶结合物的试剂，
由于去除了
Fc
段，
从而可消除
RF
的干扰。
双抗体夹心法
ELISA
试剂是否受
RF
的影响，已被列为 这类试剂的一项考核指标（参见
6.2
）
。

双抗体夹心法适用于测 定二价或二价以上的大分子抗原，
但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位 点夹心。

（二）双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，
以检测相应的
抗体。
与间接法测抗体的不 同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
此法中受检标本不需稀释，
可直接用于测定，因此其敏感 度相对高于间接法。乙肝标志物中抗
HBs
的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原 的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。