试管 无胎心杀菌率试验规程

2021年1月21日发(作者：贵州试管婴儿举荐和万家可以)












Q/KM
—

ZJ
—

—

2008











液体洗涤剂杀菌试验规程


（内部使用）














2008
年

月

日内部执行




质量管理中心实验室


引用标准


1
、

GB15979-2002
一次性使用卫生用品卫生标准

2
、

QB/T2738-2005
日化产品抗菌抑菌效果的评价方法

3
、

QB/T2850-2007
抗菌抑菌型洗涤剂

4
、

2002
年版

《消毒技术规范》

(
中华人民共和国卫生部

)
5
、

2001
年版


（科技出版社）

《药品微生物学检验手册》

杀菌率试验规程


1
、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度

试验菌种：金黄色葡萄球菌（

ATCC 6538
），大肠杆菌（

8099
或

ATCC 25922
），白色念珠菌。

试验温度：

20
℃±

1
℃。

作用时间：

最短不得小于

30s
。常规作用时间为

2min
、
5min
、
10min
、

20min
。

试液浓度：

中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。

菌悬液用量：正式

杀菌试验

用菌悬液的浓度、取量应与

中和剂鉴定中

1
组、

2
组所用

菌悬液的浓度、

取量相同。

2
、

细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序

：

2.1
菌悬液的制备

⑴

取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入 适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。

取含

5.0ml-10.0ml
营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置


37
℃培养

18h
～
24h
。用接种环取第

1
代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于

型菌落，接种于营养琼脂斜面，于

37
℃培养

18h
～
24h
。挑取上述第

2
代培养物中典

37
℃培养

18h
～
24h
，即为第


3

代培养物（放在

4
℃左右冰箱中保藏。

每隔

2-3
个月移种一次，继续保藏。

）
。

⑵

取第

3
代～

14
代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经

18h
～

24h
培养），用

5.0ml
吸管吸取

5.0ml
吸管将洗液移至另一无菌

3.0ml-5.0ml
稀释液加入斜面试管内

，

反复吹吸，洗下菌苔。随后，用

试管中，在手掌上振敲
80
次（力度适中，勿溅出）

，以使细菌悬液均匀。或从新鲜菌种斜面沾取少量菌

苔，
接种在适合试验菌生长的培养基中，

37
℃培养

18h
～

24h
（或适宜时间）。作为原菌液。（源于《药品

微生
物学检验手册》

211
页）

应当

⑶

细菌繁殖体悬液应保存在

4
℃冰箱备用。

尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。

天使用不得过夜。


回收菌数为

1
×
10
～
9
×
10

4
4
cfu/ml
用

PBS
液配置

GB15979-2002
《一次性使用卫生用品卫生标准》

回收菌数为

1
×
10
—

5
×
10
cfu/ml
用

TSB
营养肉汤配置—

2002
《消毒技术规范》

8
8
2.2
、菌片的制备程序

：
《消毒技术规范》

⑴
< br>取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。

取含

5.0ml-10.0ml
营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置


37
℃培养

18h
～
24h
。用接种环取第

1
代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于

型菌落，接种于营养琼脂斜面，于

37
℃培养

18h
～
24h
。挑取上述第

2
代培养物中典

37
℃培养

18h
～
24h
，即为第


3

代培养物。

18h
～

24h
培养），用

5.0ml
吸管吸取

⑵

取第

3
代～

14
代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经

3.0ml-5.0ml
TSB
营养肉汤

加入斜面试管内

，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用

5.0ml
吸管将洗液移至另一

无菌试管中，在手掌上振敲

80
次，以使细菌悬液均匀，含菌量

1
×
10
—

5
×

10
cfu/ml
。

8
8
⑶用无菌镊子夹住已灭菌

10mm*10mm
滤纸一角，一面朝上，注入

10ul
菌悬液，放到无菌平板内，

37
℃

温箱中干燥

20min-30min
，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。每个菌片回收菌落，按活菌培养计数

所
得结果，应为

5
×

10
—

5
×

10
cfu/
片。
）

5
6
⑷细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在

自然死亡。（应当天使用不得过夜。

）

3
、操作程序

3.1
、悬液定量法杀菌试验操作程序

4
℃冰箱内。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的

⑴、
< br>样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释

液）
试验样液。

⑵、

将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。


⑶、

配制菌悬液，浓度为

1
×
10
～
9
×
10

4
4
cfu/ml
—

GB15979-2002
《一次性使用卫生用品卫生标准》或

1
×
10
—
5
×
10 cfu/ml
—

2002
《消毒技术规范》

⑷、

取杀菌试验用无菌大试管，先加入

20
±
1
℃
5min
，用无菌吸管吸取步骤

0.5ml
试验用菌悬液，再加入

0.5ml
有机干扰物质，混匀，置

8
8
1
中的试验样液

4.0ml
注入其中，

立即开启计时器，

并迅速混匀

（在

手掌上振摇

80
次）。
-
见《消毒技术规范》

或吸取试验用菌悬液

0.1ml
，加入到含

5ml
样液的试管中，立

即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇

80
次
）
。

-
见

QB/T 2738-2005
⑸、

作用

2min
、
5min
、
10min
、
20min
，即刻用无菌吸管吸取

0
.5ml
移入鉴定合格的

4.5ml
中和剂溶液

中
（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用


10min
后，取样液、

10
倍

系列稀释液

0.5ml
（见

GB15979-2002
）或分别吸取

1.0 ml
（
-
见《消毒技术规范》

）（见图四），置于

2
个灭菌平皿，用凉至

40
～
45
℃营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）

15ml
作倾注，转动平皿，

使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，

35
℃±
2
℃培养

48h
（细菌）或（酵母菌）

25
℃±
2
℃培养

72h
，

作活菌菌落计数。

⑹、

同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。

⑺、

阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。

⑻、

计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在

15cfu
～
300cfu
的平板为准，每

个稀
释度

3
个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该

3
个平板的菌落平均值作为结果；若有

2
个符

合合乎上
述标准，则以该合格的

2
个平板菌落的平均值作为结果。

⑼、

试验重复

3
次，求其平均值。根据各组活菌浓度（

cfu/ml
），计算杀菌率，见计算公式

1
。或根据

2
。

各组活菌浓度换算为对数值（

N
），计算杀灭对数值，见计算公式

3.2
载体法杀菌试验操作程序

⑴、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。

⑵、吸取样液

5.0ml
放入灭菌平皿，另吸取

PBS 5.0ml
注入平皿中，作为阳性对照皿。每皿用无菌镊子

夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。

⑶、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含

与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。

5.0ml
中和剂的试管中（中和剂的浓度

(
见图三

)
⑷、中和

10min
后，取样液或

10
倍系列稀释液

1.0ml
（（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至

40
～

45
℃
营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）

15ml
，转动平皿

10-20
下，使其充分均匀，凝固

后，于

35
℃±
2
℃培养

48h
（细菌）或

72h
（酵母菌），作活菌菌落计数。

⑸、试验重复

3
次，求其平均值。

⑹、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。

A
、

PBC
液（

0.03mol/L
磷酸盐缓冲液）、

B
、

无菌标准硬水

1ml
置于灭菌平皿内、

C
、

空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）

15ml
培养。

⑺、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在

15cfu
～
300cfu
的平板为准，每

个稀
释度

3
个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该

3
个平板的菌落平均值作为结果；若有

2
个符

合合乎上
述标准，则以该合格的

2
个平板菌落的平均值作为结果。

4
、计算公式

1
、杀菌率

X1
＝（

A
－

B
）
/ A
×
100%
式中：

X1
—杀菌率（

%
）
；

A--
对照样品平均菌落数；

B--
被试样品平均菌落数。

2
、杀灭对数值（

KL
）＝对照组平均活菌浓度的对数值（

No
）－试验组活菌浓度的对数值（

Nx
）

备 注：计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平

均生产菌落数，小于等于

1
时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。

5
、评价标准

杀菌率≥

90%
，产品有杀菌作用。

悬
液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数
值≥

6
、

操作要点：（消毒技术规范

2002
版）

1
、

对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂

；

5.00
，可判定为消毒合格。

溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）

2
、

即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；

3
、
< br>在
将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物

接触过久。




审核：


编制：


中和剂悬液定量鉴定试验操作程序

引用标准：

QB/T2738-2005
GB 15979-2002
2002
日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在

一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在

7
7
—

5
×
10

消毒技术规范（试验菌悬液在

1
×

10
cfu/ml
）

1
×
4

10
4
—

9
×
4

10
4
cfu/ml
）

—

9
×

10

1
×

10
cfu/ml
）

一、定义和术语


中和剂

—在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀

菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。

中和产物

—中和剂加杀菌剂（样品）

=9
：
1
，作用

10min
配置而成。

二、

中和剂鉴定试验原理

中和剂鉴定试验原理


试验分组

第

1
组

杀菌剂

＋
菌液

→培养

第

2
组

（
杀菌剂

＋
菌

液

）＋

中
和剂

→培养


第

3
组

中和剂

＋
菌液

→培养

第

4
组

（
杀菌剂

＋
中

和剂）

＋
菌液

→培养


第

5
组

阳性菌数对照

第

6
组

阴性对照。







观察杀菌剂对

试验菌有无杀

灭或抑制能力

观察残留杀菌

剂被中和后，

受到杀菌剂作


观察中和剂是

否抑菌。




观察中和产

物，或未被完

全中和的残留

杀菌剂对试验




阳性对照组。




阴性对照组。

试验目的




用后的试验菌



是否能恢复生

长。



菌的生长繁殖

是否有影响。