有限稀释法

2021年1月21日发(作者：夏云)
有限稀释法




有限稀释法是一种常用的克隆方法。




将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出
1mL
的细胞数。


用
HT
培养液稀释，

使细胞浓度为
50
～
60
个
/mL
，于
96
孔培养板中每孔加
0.
1mL(
五六个细胞
/
孔
)
。接种
2
排， 剩余细胞悬液用
HT
培养液作倍比稀释，再接种
2
排，如此类推，直至使每孔 含
0.5
～
1
个细胞。培养
7
～
10d
后 ，选择单个克隆生长的
阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复
3
～
5次，直至达
100
％阳性孔率时即可，
以确保抗体由单个克隆所产生。



实验五

细胞克隆化培养技术—有限稀释法

一、实验目的：

1
、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术；

2
、学会细胞克隆形成的辩观察技能；

3
、配合抗体分泌细胞筛选技术，确定抗体分泌细胞。

二、实验原理：

克隆化培养即单细胞培养技术，
用有限稀释法进行杂交瘤细 胞克隆化培养，
可以及时确
定阳性杂交瘤细胞株，
同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的 轻、
重链基因分离而出现无抗体
分泌阴性细胞株。

一般杂交瘤细胞需经过< br>52
—
3
次反复克隆后，才能达到
100%
细胞阳性率。
该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、
突变细胞株的选择，
识别和分离。
是细胞
株的常用方法。

三、实验材料：

杂交瘤细胞、< br>25
毫升培养瓶、
96
孔细胞培养板（天津有机玻璃厂）
、移液管（< br>1
毫升、
5
毫升、
10
毫升）
、弯头滴管、倒置显微 镜、
CO
2
培养箱、白细胞计数板、计数器、盖玻片、
防水笔、
RP MI-1640
、小牛血清、青链霉素、
10
毫升刻度离心管，
00
橡胶塞，饲养细胞（
3
-6
×
10
5
/ml
、见腹 腔细胞的制备）
。

四、实验步骤：

1
、分装了每孔0.1
毫升腹腔细胞的
96
孔细胞培养板（可提前
24
小时准备 就绪，置
C
O
2
培养箱中备用）
；

2
、 自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦可自
24
孔培养板孔中收集）
，制成< br>悬液。

3
、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在
1 0
5
/
毫升左右。

4
、取
3
支
10
毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上，先用无血清培养基将细胞
稀释至
10
3
/
毫升，再用含
15%
小牛血清的完全培养基稀释到
10
1
/
毫升细胞，即每
0.1
毫升
1
个细胞。

5
、每孔
0.1
毫升细胞悬液。

6
、置37
℃
5%CO
2
培养箱，
4
天后取出观察，并在板盖 上打上标记，做好记录并统计结
果。

7
、继续培养时，则在第
4- 5
天更换
1/2
培养基，约第
7-9
天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测
1-2
次。

8
、选择单克隆生长孔，生 长良好，阳性强者，转移到
24
孔板再做克隆经培养或扩大
培养。

五、实验结果：

实验结果以总细胞孔（如
96
孔）中出现克隆孔统 计出克隆百分率，并可进一步按单细
胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。

六、注意事项：

1
、注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理；

2
、计数 细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太
低；

3
、在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板；

4
、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清；

5
、若做克隆抗体检测时，特别要保护细胞的生长状况，防止细胞生长不良甚至丢失。

七、说明：

哺乳动物细胞通过分离、稀释接种，培养在适宜于单细胞生长的培养液中 ，形成细胞
克隆。
运用这项技术可以制作细胞成活曲线，
即在接种相同数量细胞的培养 瓶中，
加入不同
浓度的化学药品，
或照以不同剂量的射线，
观察其对细胞的听 见害程度。
由此可以在哺乳类
细胞中进行诱变试验及分离突变细胞