有限稀释法讲解学习

2021年1月21日发(作者：马天宇)
稀
释
法




有
限

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有限稀释法



有限稀释法是一种常用的克隆方法。



将需要再克隆的细胞株 自培养孔内吸出并作细胞计数，计出
1mL
的细胞
数。

用
HT
培养液稀释，

使细胞浓度为
50
～
60
个
/mL
，于
96
孔培养板中每
孔加
0.1 mL(
五六个细胞
/
孔
)
。接种
2
排，剩余细胞悬 液用
HT
培养液作倍比
稀释，再接种
2
排，如此类推，直至使每孔含
0.5
～
1
个细胞。培养
7
～
10d
后， 选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复
3
～
5
次，直 至达
100
％阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。



实验五

细胞克隆化培养技术—有限稀释法

一、实验目的：

1
、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术；

2
、学会细胞克隆形成的辩观察技能；

3
、配合抗体分泌细胞筛选技术，确定抗体分泌细胞。

二、实验原理：

克隆化培养即单细胞培养技术，用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化 培
养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的
轻、重链基因分离 而出现无抗体分泌阴性细胞株。

一般杂交瘤细胞需经过
52
—
3< br>次反复克隆后，才能达到
100%
细胞阳性率。

该办法亦适用于一般 细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和
分离。是细胞株的常用方法。

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三、实验材料：

杂交瘤细胞、
25
毫升培养瓶、
96孔细胞培养板（天津有机玻璃厂）、移液
管（
1
毫升、
5
毫升、
10
毫升）、弯头滴管、倒置显微镜、
CO
2
培养箱、白细胞
计数板、计数器、盖玻片、防水笔、
RPMI-1640
、小牛血清、青链霉素、
1 0
毫
升刻度离心管，
00
橡胶塞，饲养细胞（
3-6
×10
5
/ml
、见腹腔细胞的制备）。

四、实验步骤：

1
、分装了每孔
0.1
毫升腹腔细胞的< br>96
孔细胞培养板（可提前
24
小时准备
就绪，置
CO
2
培养箱中备用）；

2
、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦 可自
24
孔培养板孔中
收集），制成悬液。

3
、按白细胞 计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在
10
5
/
毫升左右。

4
、取
3
支
10
毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上 ，先用无血清培
养基将细胞稀释至
10
3
/
毫升，再用含
1 5%
小牛血清的完全培养基稀释到
10
1
/
毫
升细胞，即每
0.1
毫升
1
个细胞。

5
、每孔
0.1
毫升细胞悬液。

6
、置
37
℃
5%CO
2
培养箱，
4
天后取出观察，并在板盖上打 上标记，做好
记录并统计结果。

7
、继续培养时，则在第
4-5< br>天更换
1/2
培养基，约第
7-9
天可以收获培养
液上清用于 检测抗体。并重复检测
1-2
次。

8
、选择单克隆生长孔，生长良 好，阳性强者，转移到
24
孔板再做克隆经
培养或扩大培养。

五、实验结果：

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