精子质量评价

2021年1月21日发(作者：罗让)
精子质量评价规程

一、

原理与意义

精子活 力、
精子存活率和精子计数是评价精子质量的三个主要指标。
剖杀雄性动物，
取单侧附 睾，在预热的培养液中剪碎，孵育一定时间后，进行各项指标检测。精子活力：
先计数
a
级（快直线运动，≧25

um/s
，即大于
5
个精子头）和b
级
(
慢直线运动，
5
～
24
um/s，即小于
5
个精子头
)
，再计数
c
级（原地打转或运动 迟缓，≦5

um/s
）和
d
级（无
活力）用血球计数板进 行精子计数。精子存活率：用伊红染液和精子悬液混匀后，观察
活精子（头部白色）和死精子（头部红色 ）分别所占比例。精子计数：用精子固定液和
精子悬液混匀后，观察红细胞计数区域（
25格，每格含有
16
小格）至少
5
大格（周边
4
格＋中间
1
格）的精子总数。

二、

试剂及其配制

1
、含
0.1
％

BSA
(
小牛血清蛋白
)
的
F12
培养液（
4
℃保存， 用前限量预热，当日现配
,
无菌操作
,
当变色后不可再用）
。

2
、精子固定液（
50 g NaHCO
3
＋
36～
40%
甲醛溶于双蒸水至
1000 ml
，
4
℃保存）

3
、
0.67
％

伊红染液（
0.67 g
伊红＋
0.9 g
NaCl
溶于
100 ml
双蒸水，常温下保存，用前
限量预热）
。

三、

仪器设备

光学显微镜、
血细胞计数板、
计数器、
定时器、
擦镜纸、
纱布、
盖玻片
(20
mm
×
20 mm)
、
载玻片、水浴锅、剪刀、镊子、一次性吸管、离心管、移液器、枪头等。

四、

操作步骤

本实验分为三个部分：精子活力、精子存活率、 精子计数。这三个部分要按一定时
间顺序操作。

操作顺序
：杀死动物，取下单侧附睾（快速）→

放入
37
℃预热的含
3 ml F12
培养
液的小烧杯中，剪碎（精子充分释放）

→
37
℃孵育
5min
后，精子计数检查

→

再加
入
2 mlF12
培养液，
37
℃再孵育
5 min
后，精子活力检查

→

同时 再孵育
5min
～
10min
（可调整）立刻进行精子存活率检查。


1
具体操作：

1
、

精子计数检查

（
1
）取单侧附睾，放入预热的含
3 ml F12
培养液的小烧杯中，剪碎；

（
2
）
37
℃孵育
5 min
后，用剪头的一次性吸管充分将烧杯内液体混匀（重要）
， 在小管
中按
1:1
加入
50 ul
精子悬液和
50 ul
精子固定液，充分混匀；

（
3
）加
6 ul
入计数池一侧，将计数板放入湿盒中
10 min
（可调整）
；

（
4
）在
16
×
10
倍镜下，红细胞计数区域（< br>25
格，每格含有
16
小格）至少观察
5
大格
（周边
4
格＋中间
1
格）
。其中，精子头部在双线最左和最上处计数，而精 子头部
在双线最右和最下处不计。
只有精子头部没有尾部计，
只有精子尾部没有头部不 计。

2
、

精子活力检查

（
1
）精子计数取出
50 ul
精子悬液后，再在烧杯中加入
2 mlF12
培养液，
37
℃再孵育
5
min
，用吸管充分混匀后，加
6 ul
入预热计数池一侧
;

（
2
）立即在
16×
10
倍镜下观察，在白细胞计数区域（红细胞计数区外围，分四个区，
每区12
格）任选九格（刚好在镜下包括的视野）迅速计数，先计数
a
级（快直线运动，≧25

um/s
，即大于
5
个精子头）和
b< br>级
(
慢直线运动，
5
～
24
um/s
，即 小于
5
个精子头
)
；再计数
c
级（原地打转或运动迟缓，≦ 5
um/s
）和
d
级（无活力）
。

3
、

精子存活率检查

（
1
）精子活力取出
6 ul
精子悬液后，再孵育
5 min
～
10 min
（时间可调整）
；

（
2
）在载玻片上加入预热的
0.67
％伊红染液
6 ul
，再加入
6 ul
精子悬液，在玻片上用
移液器混匀；

（
3
）盖上盖玻片，快速读片，可在高倍镜
40
×
16
倍 镜下同时计数死
/
活精子。白色的为
活精子，红色的为死精子。

五、

结果计算与评价

1
、精子计数检查



红细胞计数板上最小的方格
=1/4000
mm
3
，
1 mL=10
3
mm
3





最终检测红细胞计数板五个大方格，
每个大方格含
1 6
个小方格，
共计数
80
个小方格。

则：
两侧附 睾总精子数为（个
/ml
）
=
4
×
10
6
×（五格精子数
/80
）×
2
（两侧附睾）


2