为什么做试管婴儿一个月后没实验方案

2021年1月20日发(作者：做试管引起多囊)

（
1
）可溶性糖含量测定
(10
月为
0.1g)
采用蒽酮比色法。准确称取待测样
0.3g
，先在样品中加入少量石英砂充分研磨，加
10ml
蒸馏水后放入试管中，沸水浴提取
30min
，然后将提取液过滤到
25ml
容量瓶中，反复
漂洗试管及残渣，定容至刻度线。吸取样品提取液
0 .2ml
于试管中，加去离子水
1.8ml
，然
后向各试管中加入
0 .5ml
蒽酮乙酸乙酯试剂和
5ml
浓硫酸，
充分振荡，
立即将试管 放入沸水
浴中，精确保温
1min
，取出后自然冷却至室温，以空白做参比，在
630nm
下测其吸光度。

可溶性总糖的含量（
mg
·
g-1FW
）
=C
×
Vt/
（
Vs
×
W< br>）

式中
C:
查标准曲线得糖含量（
ug
）
;
vT:
提取液总体积（
ml
）
;
vs:
测定时取样量
;
（
ml
）

w:
样品鲜重（
g
）

蒽酮乙酸乙酯
:1g
蒽酮溶于
50ml
乙酸乙酯中，避光，加热贮藏于棕色瓶中。

9.2mo l/l
高氯酸：
73.7ml
高氯酸定容于
100ml
容量瓶

标准曲线

管号

葡萄糖液（
mg/ml
）

蒸馏水

葡萄糖含量（
ug
）

0
0
2.0
0
1
0.2
1.8
20
2
0.4
1.6
40
3
0.6
1.4
60
4
0.8
1.2
80
5
1.0
1.0
100
葡萄糖标准液：准确称取
100mg
分析纯无水葡萄糖溶于蒸馏水并 定容至
1000ml
。

（
2
）淀粉
(10
月为
0.1g)
采用蒽酮比色 法。将提取可溶性糖的过滤液残渣用
10ml
去离子水转移到试管中，放入
沸水浴15min
，再加
9.2mol/L
高氯酸
2ml
，充分提取< br>15min
。然后冷却过滤，用去离子水定
容至
25ml
容量瓶中。< br>吸取
0.2ml
提取液于试管中，
依次加入
1.8ml
去离子 水、
0.5ml2%
蒽酮
乙酸乙酯及
5ml98%
的浓硫酸，
然后在振荡器上充分振荡混匀，
立即投入到沸水浴保温
1min
，
自然冷却 后在
630nm
波长下测定
OD
值，
每个处理重复
3
次。
得到的
OD
值代入葡萄糖保准曲
线查找相应的葡萄糖含量，按下式计算 出样品中淀粉含量。

淀粉含量（
mg
·
g-1FW
）
= C
×
Vt
×
0.9 /
（
Vs
×
W
）

式中
C:
查标准曲线得糖含量
;
vT:
提取液总体积（
ml
）
;
vs:
测定时取样量
;
（
ml
）

w:
样品鲜重（
g
）

标准曲线

管号

淀粉标准液（
ml
）

蒸馏水（
ml
）

淀粉含量（
ug
）

0
0
2.0
0
1
0.4
1.6
40
2
0.8
1.2
80
3
1.2
0.8
120
4
1.6
0.4
160
5
2.0
0
200
淀粉标准液：准确称取
100m g
纯淀粉，放入
1000ml
容量瓶中，加入
600-700ml
蒸 馏水，放
入沸水浴中煮
30min
，冷却后加蒸馏水至刻度。此即为每毫升含淀粉100ug
的标准液。

（
3
）可溶性蛋白质含量测定

考马斯亮蓝比色法。称取鲜样品
0.3g
，置于事先在冰箱预冷过的研钵中，然后在研 钵
中加入少量石英砂，并加入
1mlpH=7.8
（
0.05mol/L）的磷酸缓冲液充分研磨，倒入离心管
中，再用
4ml
磷酸缓冲液分两次清洗研钵 ，冲洗液一并倒入离心管中，在
10000r/min
冷冻
离心机下离心
15 min
，
上清液为过氧化物酶
（
POD
）
、
超氧化 物歧化酶
（
SOD
）
和丙二醛
（
MDA
）
、


可溶性蛋白质粗提液。

取上清液
1ml
， 并加入
5ml
考马斯亮兰
G
—
250
溶液，混合摇匀，放置
1Omin
后，测定
其在
595nm
波长下的吸光光度值。

可溶性蛋白含量（
ug
·
g-1FW
）
=(C
×< br>Vt)/(Vs
×
W
×
1O00)
式中
C:
查标准曲线得蛋白质含量（
ug
）
;
Vt:
提取液总体积（
ml
）
;
VS:
测定时取样量
;
（
ml
）
;
W:
样品鲜重（
g
）

考马斯亮兰
G
—< br>250
溶液：称取
0.1g
考马斯亮兰
G-250
溶于
50ml90%
乙醇中，加入
100ml85%
的磷酸，再用蒸馏水定容到
1000ml
，贮藏于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
（考
马斯亮兰过滤再用）
标准曲线

管号

蛋白质标准液（
ml
）

蒸馏水（
ml
）

蛋白质含量（
ug/ml
）

0
0
1.0
0
1
0.2
0.8
20
2
0.4
0.6
40
3
0.6
0.4
60
4
0.8
0.2
80
5
1.0
0
100
称取
25mg
牛血清蛋白加水定容于
250ml
容量瓶中

（
4
）游离氨基酸含量

游离氨基酸的测定采用茚三酮比色法。称取新鲜材料
0.3g
，
加入
5mL
浓度为
10%的乙酸研磨，
放入试管中，用去离子水定容到
10mL
后再过滤。取上清液
lmL
，加入
1ml
蒸馏水，再加入
水合茚三酮试剂
3mL
，
0.1%
抗坏血酸溶液

，沸水浴
15min
，取出后用 冷水快速冷却并
不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色时，用
60%
乙醇定
容至
20mL
。混匀后在
570nm
波长下测 定吸光度，通过标准曲线来计算游离氨基酸的含量。

游离氨基酸含量
=(C
×
Vt)/(Vs
×
W)
式中：
C
为从标准曲线上查得的氨基态氮含量（
μ
g
）
；< br>
Vt
为样品稀释总体积（
ml
）
；

Vs
为测定时样品体积
(ml)
；

W
为样品鲜重
(g)
。

水合茚三酮：称取
0.6 g
再结晶的茚三酮置烧杯中，加入
15ml
正丙醇，搅拌使其溶解。
再加入< br>30ml
正丁醇，最后加入
9mlPH5.4
的乙酸
-
乙酸钠 缓冲液，混匀，贮藏于棕色瓶，置
4
℃下保存备用，
10d
内有效。

乙酸
-
乙酸钠缓冲液
（
PH5.4
）
：
称 取乙酸钠
6g
加入
5ml
无氨蒸馏水，
再加入
17ml乙酸。

标准氨基酸：
称取
80
℃下烘干的亮氨酸
46 .8mg
，
溶于少量
10%
异丙醇中，
用
10%
异 丙醇
定容至
100ml
。取次液
5ml
用蒸馏水稀释至
50 ml
，即为含
5ug/ml
氨基氮之标准液。

0.1%
抗 坏血酸：称取
50mg
抗坏血酸溶于
50ml
无氨蒸馏水中，随配随用。
标准曲线

管号

标准氨基酸
/ml
蒸馏水
/ml
水和茚三酮
/ml
抗坏血酸
/ml
0
0
2.0
3.0
0.1
1
0.2
1.8
3.0
0.1
2
0.4
1.6
3.0
0.1
3
0.6
1.4
3.0
0.1
4
0.8
1.2
3.0
0.1
5
1.0
1.0
3.0
0.1


每管含氮量
/ug
0
1
2
3
4
5
标准氨基酸：称取亮氨酸
46.8mg
，溶于
10%
异 丙醇，并定容至
100ml
。取此液
5ml
用蒸馏水
稀释至
50ml
，即为含
5ug/ml
氨基氮之标准液。

（
5
）脯氨酸含量测定

采用酸性茚三酮比色法。
称取不同 处理的剪碎混匀的样品
0.3g
，
置于试管中，
然后加入
5ml < br>3%
磺基水杨酸溶液，用保鲜膜封口，在沸水浴中提取
30min
，待冷却至室 温后过滤至干净的
试管中。吸取
2ml
提取液
（
10
月为< br>1ml
）
，加入
2ml
冰醋酸和
2ml
酸性茚三酮< br> (2.5%
酸性茚
三酮
)
，于沸水浴中加热
30min。取出冷却后向各管加入
4ml
甲苯充分振荡
30s
，静置片刻，
取上层液
10ml
于离心管，在
3000r/min
下离心
5mi n
，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯
溶液于比色皿中，以甲苯为空白对照，于
52 0nm
波长处比色，记录吸光度值。


通过标准曲线计算出
2ml
测定液中脯氨酸的浓度
x(ug/ml)
，然后计算样品中脯氨酸含
量 的百分数。

脯氨酸含量
(
μ
g/gFW
或
DW) =(C
×
V/a)/W
式中：
C-
标准曲线所得提取液中脯氨酸浓 度（
μ
g
）
；

V-
提取液总体积（
ml
）

a-
测定时所吸取提取液的总体积（
ml
）

W-
样品重（
g
）

3%
磺基水杨酸：
3g
磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容于
100ml
2.5%
酸性茚三酮：
1.25g
茚三酮溶于
30ml
冰醋 酸和
20ml6mol/l
磷酸中，
搅拌加热溶解，
贮藏于冰箱中。

6mol/l
磷酸：浓度为
85%
的磷酸大约是
14mol/l，如果要配置
6mol/l
的磷酸大约稀释
到原来体积的
2.3
倍。

标准曲线

准确称取
25mg
脯氨酸，定容到
250ml
，此标准液中每毫升含脯氨酸
100ug
。取
6
个50ml
的
容量瓶，分别盛入脯氨酸原液
0.5ml
、
1.0m l
、
1.5ml
、
2.0ml
、
2.5ml
及3.0ml
，用蒸馏水定
容至刻度，
各瓶的脯氨酸浓度分别为
1ug/m l
、
2
ug/ml
、
3
ug/ml
、
4
ug/ml
、
5
ug/ml
、
6
ug/ml
。
吸取各管标准液
2ml
。

（
6
）饱和脂肪酸含量

（
7
）不饱和脂肪酸含量

（
8
）总氮含量

定标溶液的配制
:
取氯化钱3.8199
放入
1000ml
容量瓶中，
加入蒸馏水使之溶解并定容。
另取
100ml
洁净的容量瓶
10
个，依次加入上述母液
0
，
2
，
4
，
6
，
8
，
9
，
10
，
12ml
，并分别
摇匀定容。

样品消化
:
称取
0.3g
样品于消化管底部，在消化管中加入
15m l
浓硫酸，
2g
高氯酸，消
煮
40min
后消化液变为澄清 透明，这时停止消化
;
待消化液冷却后，转入
100ml
容量瓶中，
用蒸馏水少量多次冲洗消化管，冲洗液也转入容量瓶中，冷却，定容，混匀备用。

样品测定< br>:
按照流动注射分析仪
(FIAstar5000)
的相关操作要求，
将消化液和定标溶液上
机测定，可得到全
N
的浓度。

N
含量计算
:
N
含量
(mg/g)=(C
×50)/(W
×
1000)
式中
c:
流动注射分析仪测得相对浓度
(mg/l);
w:
样品干重
(g)
。

（
9
）多糖组分含量