试管宫腔灌注卵母细胞成熟过程中添加MG132促进了体细胞核移植之后的胚胎发育且改变了卵母细胞和胚胎的

2021年1月20日发(作者：成都哪个医院试管婴儿)

MG132 Treatment During Oocyte Maturation Improves Embryonic Development

After Somatic Cell Nuclear Transfer and Alters Oocyte and Embryo Transcript

Abundance in Pigs

卵母细胞成熟过程中添加
MG132
促进了体细胞核
移植之后的胚 胎发育且改变了卵母细胞和胚胎的












基因表达水平


摘要

本研究的目的是在卵母细胞体外成熟
（
IVM
）过程中添加一种蛋白酶体抑制
剂
MG132
，
检测其对卵母细胞成熟和胚 胎发育的影响。
在一系列的实验过程中。

来源于中等卵泡（直径
3-8mm
）的卵母细胞在
IVM
过程中用
MG132
处理，
分别为< br>0-22
小时（
M0-22
）
,30-42
小时（
M 30-42
）
,
以及不添加
MG132
的对照组
（
MCO
）
。结果，在核成熟和胞质成熟上没有显著影响（通过评估细胞内谷胱甘
肽和< br>P34
cdc2
激酶的活性）
，然而，在孤雌激活（
PA
）和 体细胞核移植
(SCNT)
后
囊胚的形成上，
实验组显著高与对照组，
具体为：
M30-42
组
PA
为
65.2%
，
SCNT

为
27.7%
；
M0-22
组
PA45.3%
，
SCNT

19.5%
；
MCO
组
PA 42.6%
，
SCNT 13.6%.
基因的表达上，
M30-42
组
IVM
卵母细胞
PCNA,

ERK2
表达增加，
而
4-cell SCNT
胚胎
POUF51
、

DNMT1
、

FGFR2
、
PCNA
表达增加。




来源小型卵泡（直径
<3mm
）的卵母细胞在
IVM
过程中用
MG132
处理，分
别为
0-22
小时
（
S0-22）
,30-42
小时
（
S30-42
）
, 0-22< br>小时
MG132
处理后再
30-42
小时
IVM
（< br>S0
–
22/30
–
42
）以及不添加
MG132< br>的对照组（
SCO
）
。结果，
SCNT
后在囊胚的形成上，< br>S30-42

为
16.5%
和
S0
–
22 /30
–
42
为

20.8%
，高于
SCO
为
8.7%
和
S0
–
22
为
8.8%
； 在基因表达上，
S30-42
和
S0
–
22/30
–
42
组，
POU5F1
、

DNMT1
、
FGF R2
和
PCNA
都高于
SCO
和
S0
–
2 2
组。


结论：在猪中，
IVM
后期阶段用
MG132
处理卵母细胞，提高了胚胎的发育
和改变了基因的表达。


介绍

先进的生殖技术包括体外受精
IVF
、
胞质内精子注 射、
体细胞核移植
SCNT
。
这些技术使得通过体外生产胚胎来繁殖后代成为 一种实际惯例，
并广泛应用在很
多哺乳动物上。
为获得高成功率，
体外胚胎生 产需要高质量的、
成熟的卵母细胞。
为了提高卵母细胞的发育能力，在体外成熟系统（
IVM
）上已经做了很多修改，
包括使用生长因子、抗氧化剂
(Abeydeera et al., 1998; De Matos and Furnus, 2000;
Mito et al., 2009)
，
和用一些化学药品促进减数分裂的同步化，
包括二丁基 环单磷
酸腺苷或环己酰亚胺
(Funahashi et al., 1997;Ye et al., 2002).
猪卵母细胞相较于牛和羊的卵母细胞，
体外培养到成熟需要更长时间 。
在控
制体细胞和卵母细胞周期进程上，
协调合成和蛋白降解扮演了重要角色
(Peters,
1999; Moor and Dai,2001)
。相关文献报道了泛 素蛋白酶体通路
(UPP)
介导的蛋
白质凋亡对于猪、小鼠、大鼠胚胎的减数分裂成熟 来说，是个基本过程。此外，
特殊蛋白如泛素
C
末端水解酶
L1
和泛 素
C
末端水解酶
L3
与猪减数分裂成熟相关。

(Susoret al., 2007; Yi et al., 2008)
。在卵母细胞 成熟过程中用蛋白酶体抑
制剂处理能够调节减数分裂，这是通过影响调节蛋白如周期蛋白
B1< br>和促蛋白激
酶磷酸化来实现
(Josefsberg et al., 2000;Huo et al., 2004ab)
。一种特殊蛋
白酶体抑制剂，
M G132
，在一定用量、时间条件下，能诱导生发泡破裂和阻滞卵
母细胞于
M1
期
(Josefsberg et al., 2000; Chmelikova et al., 2004)
。在其
他关于猪
SCNT
的研究中，
展示了在重构胚融合 或激活后这一时间点，
用
MG132
处理，

结果
MG13 2
对
SCNT
胚胎发育起到了积极影响
(Whitworth
et
al.,
2009;
You et al., 2010a)
。推测：< br>MG132
处理，抑制了母源蛋白的降解，而这些母缘蛋
白对核重编程和胚胎发育是有益 的。

本研究的目的是检测在
IVM
过成中卵母细胞经
MG132< br>处理，
对卵母细胞成
熟及
PA
、
SCNT
后猪的胚胎 发育的影响。为此，我们通过检测卵母细胞成熟开
始及结束时细胞内谷氨酸含量、成熟促进因子
MPF
活性和
PA
或
SCNT
胚胎分
裂率、囊胚率，来评估
MG132
处理的影响。此外，还检测了
IVM
卵母细胞、
SCNT
胚胎的基因表达量，如细胞周期、信号通路、转录、
DNA
甲基化的相关
关键 基因
(CDK1,
ERK2,
PCNA,
DNMT1,
FGFR2,
and
POU5F1)
。我们的结果表
明：
对猪卵母细胞在
IVM
后期用
MG132
处理，
增强了卵母细胞胚 胎发育的能力，
可能原因是通过影响了细胞质的成熟，从而增强了卵母细胞和
SCNT
胚胎的转
录。另外，
MG132
处理，不仅对中等卵泡卵母细胞且对发育能力不强的小 卵泡
的卵母细胞，都起到的积极的影响。


结果

MG1 32
对中等尺寸卵泡的
IVM
卵母细胞核成熟、
细胞内谷胱甘肽含
量 及
MPF
活性的影响（实验
1
）




正如表一所示，用
MG132
处理
0-22h
或
30-42 h
对于核成熟没有显著影响
。
空白组、
0-22h
组、
30 -42h
组卵母细胞到达
MII
的比例分别为
96.1%
、
90.2%
、
94.2%
。细胞内谷胱甘肽的含量或
MPF
活性也没 有影响。


在
PA
（实验
2
）和
SCN T
（实验
3
）后，
IVM
过程中用
MG132
处理 对胚
胎发育的影响

PA
卵母细胞在分裂率上没有影响，但是囊胚 率有影响（
P<0.05
；表
2
）
。
30-42h
组、空白组、
0-22h
组分别为
65.2%
、
42.6%
、
45.3%.
囊胚细胞数各组相
似。

SCNT
胚胎的影响
（表
3
）
。
分裂率上没影响，
但重构胚发育到 囊胚阶段
30-42h
组好于其余两组。
30-42h
组、空白组、
0-22h
组分别
27.7%
、
13.6%
、
19.5%< br>。在
囊胚细胞数上没有影响。


MG132
处理后
IVM
卵母细胞和
SCNT
胚胎基因表达（实验
4
）


一些已经熟知的对卵母细胞成熟和核重编程重要的基因被分析，验证是否
MG13 2
对核形成的影响与增加的
mRNA
的表达量有关。
IVM
卵母细胞 中，
30-42h
组能提高
PCNA
和
ERK2
的表达量，
0-22h
组则不能（图
1A
）
。在核移植胚胎中，
MG1 32
处理
IVM30-42h
，所有被分析的基因（
POU5F1
、
DNMT1
、
FGFR2
、和
PCNA
）
均增加表 达量（
p<0.05
）
，处理
0-22h
，
POU5F1
和
FGFR2
增加表达量（
p<0.05;
图
1B
）
。


来自小尺寸卵泡的卵母细胞
IVM
过程用
MG132
处理对核成熟，
细胞内
谷胱甘肽含量、和
MPF
活性的 影响（实验
5
）

中等卵泡卵母细胞核成熟和细胞内谷胱甘肽含量高于小卵泡 卵母细胞
（
p<0.05
；
表
4
）
。
MG 132
处理
IVM
后，
对核成熟和胞内相关谷胱甘肽含量没影响
（图
4
）
。而
MPF
活性
0-22h
和
30- 42h
要高于没处理组（
p<0.05;
表
4
）
.

MG132
处理小卵泡卵母细胞对
PA
和
SCNT
胚胎的发育的影响


对激活卵母细胞发育到囊胚的比例比较中，来自中等卵泡 卵母细胞要高于小
卵泡卵母细胞（
p<0.05
）
，但分裂率和囊胚细胞数上 无差异（表
5
）
。小卵泡卵母
细胞处理
MG132
后在PA
上没发现有益的影响（表
5
）
，一般来说，
MG132没有对
来自小卵泡卵母细胞产生影响，虽然有一个趋势（
p=0.07
）
：囊胚形成上
0-22h
和
30-42h
（
24.0%
）要 高于没处理组（
15.5%
）
。

SCNT
胚胎的结 果展示在表
6
。重构胚发育成囊胚的比例上，中等卵泡卵母细
胞要高于小卵泡卵母细胞
（
p<0.05
）
。
但在别的方面上两者没差异。
对比PA
胚胎
发育的影响，
IVM
过程受体细胞处理
MG132，
SCNT
胚胎发育到囊胚阶段和囊胚细
胞数上显著受到
MG132 < br>的影响。
特别地，
30-42h
组和
0-22h
联合
30-42h
组的囊
胚形成要高于对照组或
0-22h
组，
分别依次 为
16.5%
、
20.8%
、
8.7%
、
8.8%
（
p<0.05
）
。

此外，囊胚细胞数上，
30 -42h
组和
0-22h
联合
30-42h
组要高于对照组或
0-22h
组，分别依次为
55.2cells
、
52.0cells、
44.5cells
、
23.8cells
（
p<0.05< br>）
。


MG132
处理来自小卵泡的
IVM
卵母细胞和
SCNT
胚胎对基因表达的影
响

IVM
时， 相较来自中等卵泡卵母细胞，小卵泡卵母细胞所有基因表达均减
少（图
2A
）
.
小卵泡卵母细胞中，
IVM
中
MG132
处理，
PCNA
和
ERK2
的表达量在
30-42h
组和
0-22h
联合
30-42h
组均显著高于对照组（
p<0.05
）
。

中等卵泡卵母细胞在转录本的丰度上，各方面均高于小卵泡卵母细胞。相
较于小卵泡卵母细 胞的对照组来说，
用
MG132
处理
0-22h
或
0-22 h
联合
30-42h
，
增加了所有要分析的基因的转录丰度（
p<0 .05
）
，包括（
POU5F1
、
DNMT1
、
F GFR2
、