饺子做法步骤硫脲的作用

2021年1月20日发(作者：卞文瑜)

1M
硫脲
+10mM EDTA+1M
尿素可否用于解决
DNA-
蛋白质交
联？？？？



同时含有高浓度的解聚剂
尿素和硫脲
，
两者联合发挥协同作用，< br>增强溶解疏水蛋
白质效应
.

一同使用的时候通常尿素的浓度是5-7M
，而硫脲是
2M
。含有尿素的溶液在操作
时一定要注意控制温度 ，温度过高（
>37
℃）会造成分解，而温度过低可能造成
析出。


裂解液［
7M
尿素
/ 2M
硫脲
/ 1%(w/v) ASB14
（
amidosulfobetaine 14
）
/
0.5%(v/v) Triton X-100 / 30mM DTT / 40mM Tris
碱
/ 0.5% Biolytes pH3-10


7M
尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部 分蛋白
酶的活性
，
２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，
不过如果

您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。


ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）


蛋
白
酶
K
是
一
种
枯
草
蛋
白
酶
类
的
高
活
性
蛋
白
酶
，
从
林
伯
氏
白
色
念
球
菌
（
Trit irachium album Limber
）中纯化得到。该酶有两个
Ca
2+< br>结合位点，它们
离酶的活性中心有一定距离，
与催化机理并无直接关系。
然而，
如果从该酶中除
去
Ca
2+
，由于出现远程的结构变化，催化活性将 丧失
80%
左右，但其剩余活性通
常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。< br>所以，
蛋白酶
K
消化过程中通
常加入
EDTA
（以抑 制依赖于
Mg
2+
的核酸酶的作用）
。但是，
如果要消化对蛋白酶< br>K
具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有
1mmol/l Ca2+
而不
含
EDTA
的缓冲液
。在消化完毕后、纯化核酸前要加 入
EGT
（
pH8.0
）至终浓度为
2mmol/L,
以鳌 合
Ca
2+
。


蛋白酶
K
，是一种切割 活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨
基酸的羧基端肽键。
此酶经纯化去除了
RNA
酶和
DNA
酶活性。
由于蛋白酶
K
在尿素和
SDS
中稳定，
还具有降解天然蛋白质的能力，
因而它应用很广泛，
包括制备
脉冲电泳的染色体
DNA
，蛋白质印迹以及去除
DNA和
RNA
制备中的核酸酶。蛋白
酶
K
的一般工作浓度是
50
—
100
μ
g/ml
。在较广的
pH
范围内（
pH
4-12.5
）均有
活性。推荐反应缓冲液：
50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl
2
。


值得注意的是，蛋白酶
K
在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理
,
它具有消 化
包围靶
DNA
蛋白质的作用
,
以增加探针与靶核酸结合的机会,
提高杂交信号
.
但蛋
白酶
K
的浓度过高、消化时间过 长或孵育温度过高时
,
都会对细胞的结构有一定
的破坏
,
导致组织切 片的脱落
,
细胞核的消失
,
从而影响杂交结果
.
EDTA< br>缓冲液可


以替代蛋白酶
K
的
作用
,解决上述出现的问题
,
并能达到理想的染色效果
.

孵育温度 为
55
至
65
℃，理想孵育温度为
58
℃，孵育时间为15
分钟至
48
小时；
理想孵育时间为
2
小时





Marker
的相关疑问

MM.
我用的是可视
marker
（
BIO_RAD
）， 但是电泳总跑不全
8
条带，请问什么原因？怎样改
善？胶用过
8
％，
10
％，
12
％，都是这样。
marker
是新买的。
解答：一般来说，是小分子量
Marker
跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间 试试看。当然梯
度胶也是不错的选择。

NN.
用的是
Roche molecular Biochemicals
公司的由
100kd
，
75 kd
，
45kd
，
30kd
，
20kd
，
10kd
组成的
marker
。开始做
Western Blot
时 还能够看到
marker
，当然也仅能看见其中最
多三条带。用
80V
进行
SDS- PAGE
电泳，用恒压
10V45min
转印的。前几次做
Western Blot
时没有进行丽春红染色，
但尽管用了此方法也仅能看到
marker
有一条大约是
30KD
的条带出
现。再就是把
70KD
和
1 30KD
两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分
析，没有用间接法，而是 直接用融合蛋白
C
端的
V5
表位的酶联抗体（
Anti-V5-HR P
）。但就
是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！

解答：
1
、“我用的是
Roche
molecular
Biochemicals
公司的由
100kd
，
75kd
，
45kd
，
30kd
，
20kd
，
10kd
组成 的
marker
。开始做
Western Blot
时还能够看到
m arker
，当然也仅能看见
其中最多三条带。”有的时候，
Prestained
Marker
放久了效果就会变差，电泳是条带不清
晰，扩散。
但是你的问 题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。
转移
是多加点甲醇。

2
、
“前几次做
Western
Blot
时没有进行丽春 红染色，
但尽管用了此方法也仅能看到
marker
有一条大约是
30KD< br>的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就
30kd-50kd
的
转移地比较好。

3
、
“再就是把
70KD
和
13 0KD
两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，
用培养基样品进行分
析，没有用间接法 ，而是直接用融合蛋白
C
端的
V5
表位的酶联抗体（
Anti-V5 -HRP
）。”

是否检测了表达量，
二抗是否是好的，
你做了阳性 对照？你要做这么大的蛋白最好转移时间
延长到
1.5hrs
。

6.
染色的选择

OO. Western Blot
哪种染色好？

解答：
（
1
）
阴离子染料 是最常用的，
特别是氨基黑，
脱色快，
背景低检测极限可达到
1.5
μ
g
，
考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，
但脱色慢，
背景高。丽春红
S
和快绿在检测后容易从蛋
白质中除去，
以便进行随后的氨基酸分 析。
缺点是：
溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的

皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。

（
2
）胶体金，灵 敏度高，检测范围可到
pg
级，但染色比稳定。

（
3
）生 物素化灵敏度位于
1
、
2
之间，可用于任何一种膜。

7.
参照的疑问

PP.
是否
Western Blot
实验半定量一定要加
ACTIN
内参？

解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。



QQ.
用
BANDSCAN
分析结果行吗？

解答：分析一般的结果没问题。

RR.
核内抗原
Western Blot
内参选择什么合适？

解答：
可以选用组蛋白，
组蛋白在细 胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在
网上查查就可以选出你要的内参。

SS.
转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据
0.8mA/cm2
，一 般
1
小时左右？

解答：不是的，

半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。

TT.
做半定量人卵巢癌细胞系的
Western Blot
，内参
B-actin
，
GAPDH
，那个好？

解答：选用
beta-actin
就可以。

8.
缓冲液配方的常见问题

UU.
转膜后的脱脂奶粉封闭时，
所用的防沫剂
A
是什么？还有
Tris- HCl
是不是就是用
Tris
和盐酸配出来的呢？

解答：转膜后的 脱脂奶粉封闭液是
5%
的
TBST
脱脂奶粉。
Tris
－< br>HCl
就是
Tris
盐用
HCl
调
ph
值， 配置而成。

VV.
准备做大鼠脑子的
Western Blot
，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操
作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷 酸化的蛋白质，
操作时如何防止去磷酸
化的发生？

解答：可以用提取总蛋白 的
buffer
提核蛋白，可以加
NaF
防止去磷酸化。

WW.
想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞< br>膜和胞浆有区别吗？

解答：
一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了 ，
操作时保持低温。
除非有文献特
别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

XX.
最近作了两次
Western
Blot
，不但没阳性 结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，
有条带。底片和显色液及
DAB
显色液均 试过，没问题。
1
、检测
GAD--
分子量
67kd
，提取 液
有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本
--20
度放置一周内测。
2
、一抗放
置
2
年，可能效价不高！用的是
1:100< br>。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？
3
、第一
次有不均匀背景，因为一抗 过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。
4
、封闭液用的是含
15%
脱脂奶 粉
TBST
，
漂洗液用的是含
1%BSA
的
TBST
液，
TWEEN-20
为
0.1%
，
不会是封闭液的
问题吧？

解答：
可以在下面几个问题上找找原因。
1.
封闭液用
5
％
Milk
，
漂洗液
（
washing
buffer
用
TBST
）
2.
看看一抗是否能
work
，降 到
1
：
20
。
3.
看看二抗是否有问题。

YY.
加甲醇的目的是什么？

解答：
加甲醇起着一定的固定作用 ，
因为小分子蛋白质容易转出去
.(
特别是在硝酸纤维素膜
上，因为
NC
膜结合蛋白质的能力较弱
)
。

ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封 闭液是
5%
的
TBST
脱脂奶粉”，其中
TBST
最后那个
T
是
Tween
吗，浓度多大？

解答：
是
Tween
，
配方如下
:Tris- Buffered
Saline
Tween-20
(TBST),
Dissolve
8.8g
of
NaCl
，

0.2g
of
KCl
，
and
3g
of
Tris
base
in
800ml
of
distilled
H2O,
Add
500ul
of
Tween-20,
Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.

AAA.
封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢 ，比如现在我就在室温里做，或者要在
4
度下
?
解答：
均可在室温 进行，
如果时间不够，
一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后
4
度过夜。



BBB.
实验室暂无
NP40
我 用
sds
可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：
7M
尿素，
2M
硫脲，
Triton-x-100 0.2ml
，新鲜加入：
65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒
HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)
是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。
不止用于抽 提细胞全蛋白
（主要是想得到其中的膜蛋白）
是否可行？

改良的
RIPA
裂解缓冲液
(
，
50 mmol/L
，
pH 7.5; NaCl
，
150 mmol/L; NP-40
，
1%;
脱氧胆酸钠，
0.5%; SDS
，
0.1%; EDTA
，
1 mmol/L; PMSF
，
1 mmol/L; Leupeptin
，

2 < br>μ
g/ml)
不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的
EDTA
，
是否用做蛋白酶抑制剂？

解答：
做２－Ｄ绝对不推荐使用ＮＰ－４０ （因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，
，其中的
杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白 酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），
可以不使用
cocktail
，
因 为
7M
尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以
抑制大部分蛋白酶的 活性，
２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，
不过
如果您专职做膜 蛋白建议采用分级抽提法。
此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的
方法。
ＥＤ ＴＡ用于灭活金属蛋白酶
（主要是其鏊合作用）。
加过多的蛋白酶抑制剂可以导
致蛋白 质的修饰，
做ＷＢ无所谓，
做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。
裂解缓冲液中< br>少了两性电解质
(
在
2-D
裂解缓冲液中，
两性电解质起的作 用：
提供连续的
PH
梯度，
从很大
程度上增加蛋白质的溶解性
;
还可以去除一部分核酸
)
；也不推荐采用
SDS
，因
S DS
会与蛋白
质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到
0.1%< br>以下。

CCC. Western Stripping Buffer
的配方

解答：
METHOD1
1
、
stripping
buffer:
62.5mmol/l
Tris
PH6.7
；
100mmol/l
beta- mercaptoethanol
；
2%SDS
二次发光
protocol:ing buffer
洗膜：
50
度水 浴
30
分钟，摇床上摇
10-20
分钟。

2
、
1*PBST
洗：摇床上摇
30
分钟。

3
、封闭，加一抗，二抗（同第一次发光）


METHOD2
（
50ml
总量）：
?-mercaptoethanol 342
μ
l
；
20% SDS 5 ml
；
Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml
；
加
ddH2O
至
50 ml
。

方法：将用过的膜浸入
stripping buffer
中，置
50℃水浴箱中
30min
，间断振摇。之后用
TTBS
洗< br>3*5min
就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。

该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。


METHOD3
1
、
beta-metaptoethanol 35ul
2
、
10%SDS 1ml
3
、
tris (0.5M
，
pH6.7) 625ul
4
、
dH2O 3.34ml
50-
55℃，
30min
。




浅析双向凝胶电泳的样品制备