南宁试管婴儿哪家好胚胎冷冻保存技术

2021年1月19日发(作者：甲状腺癌会引起移植试管失败吗)

胚胎冷冻保存技术






摘要
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胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植 效率的目的。研
究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。

关键词：胚胎冷冻保存


为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７ 日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割
后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻 贮存就是胚胎冷冻保存技术。这是在冷冻精子的技
术基础上进一步发展起来的一项新技术。目前用冷冻胚 胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚
胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从 而达到提高胚胎移植效率的目的。

现有的胚胎冷冻保存方法有四种：

一、常规冷冻法

常规冷冻法：
也叫慢速冷冻法、
逐步降温法。将采 集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂
(
甘油
或二甲亚枫
(DMS O)
等
)
浓度的三种冷冻液中
(
冷冻液浓度由低到高，最终浓度1
．
4M)
，每种冷冻液中平衡
5
分钟，然后将胚胎和冷冻液装 入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。冷冻速率先以
1
～
3~C
／分 下
降至
-6
～
-
7℃，在此温度诱发结晶，平衡
10
分钟，然后，以
0
．3℃／分的速率降温至
-35
～_38℃，之后
投入液氮中保存。胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每
步
5
分钟，最后置入含
20
％血清的
PBS
保护液中洗涤
3
次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放
入
0
．
5M(
或
1
．
0M)
的蔗糖溶液中平衡
10
分钟， 再用上述
PBS
液洗涤
3
次。

二、一步冷冻法

一步冷冻法：
也叫一步细管法。
该方法是由慢速冷冻法改进而来，
细管内的冷 冻液和蔗糖液是分开的，
因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。

三、程序冷冻法



程序冷冻法主要采用低浓度
冻结保存剂
梯度脱水
,
经
程序冷冻仪
缓慢降温。主要操作步 骤包括
:
将细胞
顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水
,置入程序冷冻仪快速降温至
-6
℃植冰
(
人工诱导冰

晶形成
),
然后程序冷冻仪缓慢降温至
-30
℃
~-80
℃ 后液氮贮存。


程序冷冻法主要使用渗透较慢的
低温保护剂
，
如乙二醇
(EG)
、
丙二醇
(PG)
、
甘油(G)
、
二甲基亚砜
(DMSO)
，
使冷冻保护剂充分渗透人胚 胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。程序冷冻
法采用较低浓度的冷冻保护 剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，
致使所需时间长，需要特殊 的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内
外均较少使用。


通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种
细胞渗透性冷冻保护
剂和一 种
非细胞渗透性保护剂
，于室温
下，在低浓度的
冷冻保护剂溶液
中预 平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降
温标本，经过冷冻保护剂的处理后， 胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性，


它在细胞内外电解质平衡时，胞内液冰点比胞外低。

在室温到植冰点之间降温，往往冰晶还未来得及形成，但此期可以发生温度休克。
温度休克
al
shock )
是指某些细胞在降温过快时受到损伤，甚至在冷冻过程中被破坏的一种表现。其特点是与温度变化速率 有
关，常发生在
15
℃一一
5
℃降温过程之间。这可能是由于细胞膜 脂类的相变，膜受损后渗透率改变；或在
不同的热收缩应激反应时，细胞膜结构的断裂引起的。卵磷脂被 认为有保护作用。



冷冻液通常在达到诸如一
15℃的温度而冰晶尚未形成，即处于超冷状态。为了避免过冷状态的发展，
使每一个溶液在一个特定的 温度时开始冻结，使细胞脱水逐步顺利地进行，及为了控制过冷生物样品中过
度大冰晶的形成作用，可通 过两种方法来诱发结晶：一是向液体中加入微量冰晶，较少采。二是较常用的
植冰
(seedi ng)
：用预冷至一
70
℃，或更低温度的金属棒在标本溶液冰点以下
2–
3
℃时，瞬间地接触样品
容器，可以带走大量水在液相转化为固相的潜伏热，这 样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。辅助
生殖中常采用的植冰温度是一
6
℃一

–
8
℃。目前，人工植冰比冷冻仪自动植冰可靠，用冷冻过的金属镊接触的部位应避免标本刚好所在位置，以免将样品迅速降温至细胞内冰晶形成而致死，一旦看到细胞外溶液中有一个白点样的小冰晶出现，提示溶液中已有大量冰核形成，即应立刻移开金属镊，将冷冻管放回冷冻仪，数秒钟后如再次拿出冷冻管观察，则标本溶液呈白色云雾状，提示溶液中已有大量小冰品形成，提示植冰成功。植冰在超冷状态极容易成功，否则不易进行。当麦管离开冷冻仪时，温度迅速上升。因此在诱导冰晶形成时，麦管离开冷冻仪的距离宜短，操作动作必须快，以避免温度波动过大。其次，冷冻仪的温度必须准确而且稳定。在诱导结晶后，冷冻植冰后大量冰晶形成导致大量潜热的释放，所以诱导结晶后在植冰温度保留
5
–
10
分钟以达到平衡状态。植冰使溶液浓度进一步增 高，细胞进一步脱水。



植冰后的冷冻速率非常重要。因 为如果降温过快，则细胞内的水分来不及脱出，造成在胞内液渗
透压还来不及增高，冰点还来不及降低的 情况下，由于外界温度明显降至胞内液冰点之下，细胞内形成冰
晶。如果降温过慢，由于胞外溶液中的水 逐渐结冰，剩余溶液的溶质浓度越来越高，细胞长时间地处于剧
烈变化的外界
pH
和高 渗透压中，
将导致脂蛋白的变性而引起细胞的质膜的僵硬、
收缩和受损，
这称为溶液< br>效应
(solutioneffect)
。最佳的冷冻速率应当慢到足以防止细胞内产生 冰晶；快到使细胞置于高电解质溶
液中的时间缩短到最低限度，以减少溶液效应。

植 冰后，在适宜冷冻速率下，随着冷冻过程中温度的下降，围绕胞外小冰晶将有更多的水结冰，细胞
脱水则 随着溶液中的水逐渐转变为冰晶而顺利进行。随着细胞内外水分越来越少，溶质的浓度越来越高，
细胞内 、外液渐渐变为极其粘稠的状态，此时可以将其快速投入液氮。这时，粘稠的胞内外液体立即转化
为玻璃 样的固体，
与先前溶液中形成的冰晶凝固为一体。
胚胎投入液氮前的温度对复温后的活力影响极 大。
在采用
PROH
方案时，
在一
25
℃时将胚胎投入到液 氮中保存，复温后极少胚胎存活；＿
25
℃一一
30
℃吋将
胚胎投 入液氮，复温后的存活率明显低于在一
80
℃一
100
℃时投入液态者；这说 明在使用目前的冷冻器材
的情况下，只有在较低温度下，细胞内的高浓度液体才能玻璃样固化而不至于形 成大的冰晶。虽然在低于
一
30
℃时投液氮都是可行的，但许多
IVF
中心选择更低的温度，显然是考虑到投液氮过程中标本复温，以
及标本稳定性等问题。



不论是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞 造成脱水状态，但脱水的同时
不能影响到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成的损害也是冷 冻应注意的方面之一。业已证
实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复 温过程中，必须两次经过冰晶
形成和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可 能毁于过度冰晶形成。但脱水
过度，细胞也可能死亡。理想的冷冻方案是：①找到细胞含水过多和脱水过 度之间的平衡点；②合适剂量
的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又避免“溶质效应”； ③合适的冷冻速率。

四、玻璃化冷冻法