郑州试管婴儿费用-合肥做试管婴儿提议喜得儿
1
1
范围
本标准规定了绵羊的胚胎生产和移植的供体羊的选择 和饲养管理、供体羊的超数排卵及人工授精、
手术冲卵技术及胚胎质量鉴定、
冻胚的解冻、受体羊的选择及饲养管理、
胚胎手术移植技术和妊娠受体
羊的饲养管理技术。
本标准适用于秦皇岛地区绵羊的胚胎生产和移植。
2
2
规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，
其随后所有的
修改单
（不包括勘误的内容）或修订版均不适用 于本标准，然而，
鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不 注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
DB 1303/T 098-2000
羊的人工授精技术操作规程
3
3
供体羊的选择和饲养管理
3.1
3.1
供体羊的选择
a
）
a
）
体羊品种优良、生产性能好；
b
）
b
）
传性稳定、谱系清楚；
c
）
c
）
体质健壮。繁殖机能正常，无遗传和传染性疾病。年龄在
2
岁至
7
岁为宜；
d
）
d
）
具有畜牧部门颁发的种畜禽鉴定合格证书。
3.2
3.2
供体羊的饲养管理
3.2.1
3.2.1
保持饲养环境稳定，饲养环境卫生、干燥、棚舍温度适宜。避免应激反应。
3.2.2
3.2.2
制定合理的供体羊日粮配方，保证正常的营养平衡。
3.2.3
3.2.3
满足供体羊清洁饮水的需要。
4
4
供体羊的超数排卵及人工授精
4.1
4.1
超数排卵
4.1.1
4.1.1
超数排卵的季节和发情周期：绵羊最适超数排卵季节为9
月下旬至
11
月上旬。绵羊的
发情周期在
15d
—< br>17.5d
。供体母羊在超数排卵前需观察
1
—
2
个完整的发 情周期。
4.1.2
4.1.2
用于超数排卵的激素选择
FSH
—
P
（垂体促滤泡素）
LH
—
P
（垂体促黄体生成素）
ICI80996
（氯前列烯醇）
4.1.3
4.1.3
激素剂量（注射总量
/
只）
FSH
—
P
剂量（肌注）：
120IU
—
160IU
LH
—
P
剂量：根据
FSH
的注射剂量，肌注
100
—
120IU
。
ICI80996
：肌注
0.08mg/
次，注射两次
/d
。
4.1.4
4.1.4
超数排卵方法
FSH
—
P 3
天注射法
以母羊发情之日作为发情周期 的
0d
，在母羊发情周期的第
13d
或
13.5d
（周期大 于
17.5d
的羊在第
13.5d
）开始，每天早：
（
6< br>：
00
—
7
：
00
）和晚（
18
：
00
—
19
：
00
）各注射
1
次
FSH
，连续
3
天，递减注射。
FSH
、
LH
用生理盐水稀释。
在第
5
、
6
次注射
FSH
—
P
时，同时肌肉注射
ICI8 0996
。
确定供体羊发情后立即注射
LH
。
如果
FSH
—
P
未注射完供体羊已发情，
停止注射
FSH
—< br>P
，
立即注射
LH
。
表
1
表
1
绵羊
FSH
—
P 3
天注射法
周期
天数
13
14
15
16
17
剂量
时间
早
6
：
00-7
：
00
FSH
25 IU
FSH
20 IU
FSH
20 IU
FSH
20 IU
FSH 15 IU
发情
A.I
发情
A.I
ICI80996 0.08mg
LH
：
100
单位
FSH 15 IU
发情
A.I
发情
A.I
ICI80996 0.08mg
FSH 18 IU
发情
A.I
发情
A.I
ICI80996 0.08mg
LH
：
100
单位
120IU
晚
FSH
18
：
00-19
：
00
25 IU
早
6
：
00-7
：
00
FSH
25 IU
126IU
晚
FSH
18
：
00-19
：
00
25 IU
注：
注：
A.I
表示人工授精。
FSH
20 IU
FSH 18 IU
发情
A.I
发情
A.I
ICI80996 0.08mg
4.1.5
4.1.5
供体羊发情鉴定
在第
6
次注射
FS H
—
P
时即对超排供体羊观察发情。观察时间：早（
6
：
0 0-7
：
00
），晚（
18
：
00-19
：
00
）。观察方法：试情公羊扎好试情布，放入母羊群中试情，每
30-40
只供体 羊需
1
只试情公羊，以母羊
站立接受试情公羊爬跨作为发情的标准。
4.2
4.2
人工授精
4.2.1
4.2.1
种公羊的选择标准
品种优良，谱系清楚，遗传性稳定、生产性能良好，健康无病。精液品质符合
DB
1303/T
098-2000
的规定。
4.2.2
4.2.2
人工授精操作要求
a)
采精前对种公羊外生殖器清洗 消毒。采精、精液稀释、输精用的器皿严格灭菌、消毒。
b)
稀释后的精液温度要保 持在
25
℃
-30
℃的环境中。
c)
输精前，母羊外阴部必须经过清洗消毒。
6
d)
输入 的鲜精授精精液活力在
0.7
以上，每次输精有效精子数不少于
30
×
10
。输精次数不少于
2
次。
e)
选择合适的输精枪和准确的输精部位。
4.2.3
4.2.3
人工授精的最适合时间
确认发情时立即进行第一次输精，之后 每间隔
12h
输精
1
次，一般输
2-3
次。
5
5
手术冲卵技术及胚胎质量鉴定
5.1
5.1
手术冲卵
5.1.1
5.1.1
所需主要器材
手术台
1
；剃须刀
1
；创布
2-3
块；止血纱布
若干；剪毛剪
1
；手术刀柄
1
；手术
剪
1
；止血钳
3-4
；巾帕钳
4
；持针器
1
；肠钳（带乳胶管）
1
；手术刀片
若干；缝合线；缝
合针；
镊子
2
；
φ
120mm
表面皿
若干；
φ
180mm
表面皿
若干；
6
＃
-8
＃头皮针
（尖端磨钝）
若干；
18
＃
-20
＃头皮针
（尖端磨钝）
若干；
φ
10mm
透明硅胶管
若干；
10ml
注射器
2-3
；
20ml
注射器
2-3
；
φ
8mm
玻璃管
若干；
φ
35mm
培养器
若干。
5.1.2
5.1.2
冲卵所需药品
酒精、碘酊、新洁尔灭、
0.9%
生理盐水、青霉素、链霉素、液体石蜡、肝素
5.1.3
5.1.3
冲卵液（保存液）的准备
购置杜氏磷酸缓冲液
（PBS
），
PBS
液中加
0.4%
的牛血清白蛋白即为保存液， 可用于胚胎的体外操作
和保存，也可直接作为冲卵液使用于手术法冲胚和移植。
5.1.4
5.1.4
手术冲卵技术步骤
按附录
A
做好采胚记录
5.1.4.1
5.1.4.1
制作喇叭口导卵管
a)
将
φ
8mm
的玻璃管断成
10cm-12cm
长度，洗净、烘干。
b)
将玻璃管中段放在酒 精灯上灼烧，拉长为
10cm
，直径约
3mm-4mm
即可。
c)
冷却后将中间拉细部分截断，将截下部分的一端（
φ
3mm
）在酒精 灯上烧结圆滑，但不能变形。
0
d)
在离圆滑端
3cm
处 ，用酒精灯缓慢加热，使之弯曲成
120
即可。
5.1.4.2
5.1.4.2
手术冲卵法
5.1.4.2.1
5.1.4.2.1
手术前
24h
停止饲喂草料，只满足饮水。
5.1.4.2.2
5.1.4.2.2
保定、麻醉：
将母羊仰卧保定，局部麻醉。
5.1.4.2.3
5.1.4.2.3
手术部位：
在离乳房前端约
2cm
处，腹中线的两侧均可。
5.1.4.2.4
5.1.4.2.4
术部剪毛：
剪毛范围约
20cm
×
20cm
。用肥皂水清洗手术部，同时用剃须刀剃
净毛茬，再用清 水洗净。
5.1.4.2.5
5.1.4.2.5
术部消毒：
首先用
0.1%
的新洁尔灭清洗手术部位；然后用
5%
碘酊棉球对手术
部位由中心向外扩散消毒、凉干；最后用
75%
酒精棉球对手术部位由里到外消毒、脱碘、凉 干。
5.1.4.2.6
5.1.4.2.6
避开血管，
用手 术刀于术部纵向切开
6cm-8cm
长的刀口，
将皮下结缔组织分离，
暴露肌 膜。
5.1.4.2.7
5.1.4.2.7
用手术刀将肌膜轻轻切开 ，
暴露肌肉层，
再用刀柄后端将肌肉层和腹膜钝性剥
离开。
5.1.4.2.8
5.1.4.2.8
在骨盆腔，
膀胱周围触摸子宫角 并将卵巢、
子宫引出切口外，
分别记录两侧卵
巢黄体和滤泡数。
5.1.4.2.9
5.1.4.2.9
输卵管冲胚
在超排母 羊发情后
66h-72h
从输卵管采集
2-8
细胞胚胎，进行鲜胚移植。
方法：用
6
＃
-8
＃头皮针从子宫输卵管接合部的子宫端导入 到输卵管峡部，将喇叭口导卵管从输卵
管喇叭口插入
3cm-4cm
，
导卵管 远端与￠
120mm
表面皿相接，
助手事先用
10ml
注射器抽取< br>5ml-8ml
冲卵液，
与头皮针相接，
把冲卵液缓缓推入输卵管，
胚 胎即随同冲卵液自输卵管回收到表面皿中，
另一侧输卵管
冲胚操作方法同上。
5.1.4.2.10
5.1.4.2.10
冲胚完毕后，用一定浓度的肝素溶液 喷洗内脏，洗掉凝血块。用
25
℃
-30
℃
的生理盐水将内脏冲洗干 净；将
5ml-10ml
（
25
℃
-30
℃）灭菌液体石蜡 注入腹腔，以防粘连。
5.1.4.2.11
5.1.4.2.11
供 体母羊创口采用三层缝合法。
即腹膜、肌肉连续缝合；
皮肤结节缝合，
针
脚间 距
1cm
。在肌肉与皮肤间撒适量青、链霉素粉，以防创口感染。
5.1.4.2.12
5.1.4.2.12
手术后母羊需观察
24
小时后才能跟群放牧。
手术器械在使用前用
0.5%
新洁尔灭液浸泡
0.5h
；
术者分工要明确，
严格 按外科手术规则进行自身消
毒，不得接触其他无关的物品；整个采胚过程的操作要迅速、准确、仔细，避 免生殖器官暴露过久，切
记频繁、重复触摸和拉扯生殖器官，以防脏器粘连。
5.2
5.2
胚胎质量鉴定
5.2.1
5.2.1
检卵
把盛有冲卵回收液的表面皿放在立体显微镜下，
仔细观察，
不 可遗漏，
将检出的胚胎放入盛有保存
液的￠
35mm
培养皿中。
超排 母羊发情后
66h-72h
用输卵管冲胚法采集
2
细胞、
4
细胞、
8
细胞及少数
16
细胞
胚胎。上述发育期按国际胚胎移植协会 规定的数码均表示为
2
。
5.2.2
5.2.2
胚胎的质量鉴定——形态学方法
处于发育期
2
细胞的胚胎，卵裂球 轮廓清楚，球体饱满，透明度适中，数目吻合即可定为
1
级；
1/3
卵裂球死 亡可定为
2
级；
1/2
卵裂球死亡可定为
3
级；其余定为< br>4
级。
1
、
2
、
3
级胚胎均可用于鲜胚移植 。
6
6
冻胚的解冻
进行冻胚移植时，购置的冷冻胚胎在移植前需进行解冻操作。
6.1
6.1
胚胎解冻所需的仪器、器材
立体显微镜、温度计、解冻用水杯、< br>0.25ml
塑料细管、吸卵管、细管推杆、装管器、￠
100mm
塑料
培养皿、
0.22
μ
m
针头式细菌滤器。
6.2
6.2
胚胎解冻所需溶液
保存液：含
0.4%
牛血清白蛋白的
PBS
液。
解冻液：
1M
蔗糖
/
保存液。
6.3
6.3
胚胎解冻方法
胚胎解冻方法应根据胚胎冷冻方法而定，一般采取的 方法是
1.5M
乙二醇
/
保存液（含
1M
蔗糖）冷冻
胚胎的解冻：
胚胎→
32
℃水浴
10
秒→擦干细管→用
70%
酒精棉球擦拭细管，晾干→剪去细管塞→移植（胚胎解冻
后
2-3分钟内移入受体）。
6.4
6.4
胚胎发育期与受体移植时间的对应关系
胚胎发育期
受体移植时间（发情之日为
0h
）
紧缩桑椹胚（
M
）
5.5
±
0.5d
早期囊胚（
EB
）
5.5
±
0.5d
囊胚（
B
）
6.0
±
0.5d
扩张囊胚（
EXB
）
6.5
±
0.5d
7
7
受体羊的选择及饲养管理要求
7.1
7.1
受体羊的选择
a)
情周期，无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、膘情在七成以上。
b)
年龄在
1.5
岁
-6
岁之间。
7.2
7.2
受体羊的饲养要求
受体羊单独组群加强饲养，保持环境相对稳定，避免应激反应。
8
8
胚胎手术移植技术
8.1
8.1
受体羊的同期化发情处理
8.1.1
8.1.1
同期化发情处理方法
药品：
ICI80996
（氯前列烯醇），< br>0.2mg/2ml/
支
剂量：
0.07mg/
只
/
次
方法：二次注射法 （肌注）第一次注射在任意一天；第二次注射在第一次注射后
7d
，第二次注射后
24 -96h
观察发情。受体羊发情之日为
0d
，按胚龄要求进行移植。
8.1.2
8.1.2
2
细胞——扩张囊胚的胚胎，鲜胚移植时供、受体羊发情的同期化要求
8.1.2.1
8.1.2.1
供、受体羊均采用试情公羊确认发情。观察时间：每天早、晚各一次。
8.1.2.2
8.1.2.2
把供体羊发情之日定为
0d
，与 供体羊同时发情的受体羊定为
0h
受体。比供体羊提
前
12h
发情的 定为＋
12h
受体，提前
24h
的定为＋
24h
受体。比供 体羊推迟
12h
发情的受体定为－
12h
受体，推迟
24h
的定为－
24h
受体。
8.1.2.3
8.1.2.3
鲜胚移植时
0h
受体，±
12h
受体移植效果无显著差异。如果受体缺乏， 可使用±
24h
受体。超过±
24h
的受体不再使用。
8.2
8.2
胚胎移植技术
8.2.1
8.2.1
胚胎移植季节：选在
9
月
-11
月份最为适宜。
8.2.2
8.2.2
受体移植所需器械、药品
立体显微镜
1
；手术台
1
；剃须刀
1
；剪毛剪
1
；手术刀柄
1
；止血钳
3-4
；巾帕
钳
4
；
持针器
1
；
手术刀片
若干；
缝合针；
缝合线；
创布
若干；
止血纱布
若干；
16
＃针头
（尖
端磨钝）
1
；
φ
35mm
培养器
3-4
；卡介苗注射器
若干；针头式细菌滤器
1-2
；
5ml
一次性注射
器
3-4
；酒精、碘酊、新洁尔灭、生理盐水、液体石蜡、青链霉素。
8.2.3
8.2.3
受体移植操作步骤
8.2.3.1
8.2.3.1
移植器的制作
8.2.3.1.1
8.2.3.1.1
将卡介苗注射器洗净，烘干。
8.2.3.1.2
8.2.3.1.2
拨出注射器内芯，将注射器管的前端在酒精灯上灼烧，拉制成长
5cm-6cm
，直< br>径
1cm-1.2mm
的细管。冷却后用砂片将尖端断齐，再将芯插入管内。注意：管与 芯是配套的不能搞混。
8.2.3.1.3
8.2.3.1.3
将断齐的口端在酒精灯上小心烧结，使其圆滑，但不能变形，即制成移植器。
8.2.3.1.4
8.2.3.1.4
移植器用后要立即用五蒸水冲洗干净。高压蒸气灭菌或干热灭菌后再次使用。
8.2.3.2
8.2.3.2
受体母羊的手术法移植技术
8.2.3.2.1
8.2.3.2.1
暴露生殖器官：手术过程同于供体母羊冲胚手术。
8.2.3.2.2
8.2.3.2.2
胚胎的移植部位
鲜胚采用输卵管移植；冻胚采用子宫移植。
8.2.3.2.3
8.2.3.2.3
吸取胚胎
用移植器先吸一段
1cm
长的保存液，再吸一段
0.5cm
的空气，然后吸取胚胎。含胚胎的液柱不超过
1.5 cm
。
8.2.3.2.4
8.2.3.2.4
输卵管移植
将具有黄体一侧的输卵管伞部拨开，找到管口，把装有胚胎的移植器从此 插入
3cm-4cm
，然后将胚
胎轻轻推入输卵管即可。
8.2.3.2.5
8.2.3.2.5
子宫移植
将具有黄体 一侧的子宫角取出，
用尖端磨钝的
16
＃针头在子宫壁上扎一孔，
把装有胚胎 的移植器从
此孔插入子宫腔内，伸至子宫角尖端后将胚胎轻轻推出即可。注意不要把移植器扎入子宫壁。
无论输卵管移植还是子宫移植，移植液量限制在
20
μ
l
以内。移植后要立即检查移植器中是否有胚
胎遗留。确认没有遗留后，才能进行创口缝合。
8.2.3.2.6
8.2.3.2.6
受体创口缝合：
操作步骤同于供体羊手术。
8.2.3.2.7
8.2.3.2.7
按附录
B
做好受体移植记录。
9
9
妊娠受体羊的饲养管理
9.1
9.1
受体羊要加强饲养管理，避免应激反应。
郑州试管婴儿费用-合肥做试管婴儿提议喜得儿
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