两个孩子能全给男方吗丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书

2021年1月18日发(作者：司徒玲)
丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书

1.

目的


采用
PCR
技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝 炎病毒核酸的定性检
测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。

2.

范围

适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。

3.
职责

3.1
操作人员：
负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。

3.2
专 业组组长
：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等
各方面 工作。

3.3
实验室主任
：负责监督和指导实验室各方面工作。

4.
原理

采用荧光
PCR
技术，以丙型肝炎病毒基因编 码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧
光探针，进行一步法
RT-PCR
扩 增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根
据阈循环值
(CT)
实现对未知样本的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过
程进行监控，减少假阴 性结果的出现。

5.
样本要求

5.1
适用标本类型
：血清

5.2
标本采集

用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血
2
ml
，注入无菌的真空采血管中（ 未加抗凝剂）
，室温
（
22-25
℃）
放置
30-60mi n
血标本可自发完全凝集析出血清，
或直接使用水平离心机，
1500rpm
离心
5min
；吸取上层血清，转移至
1.5ml
灭菌离心管。

5.3
标本保存和运送

所采集的标本可立即用于测试或长期保存于
-70
℃，
也可保存于
-20
℃待测，
保存期为
3
个月，
标
本应避免反复冻融。标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过< br>4
天。

5.4
拒收标本：
拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。

6.
仪器和试剂

6.1
设备

AB7500
核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。

6.2
试剂

生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司

产品标准批号：
YZB/
国

7271-2013
最低检出量：最低检出量为
500 IU/ml
试剂各组分见表
1
：

表
1

试剂盒组分表

组

分

名

称

RNA
提取液
A
核酸提取试剂

RNA
提取液
B
DEPC H
2
O
HCV
内标溶液

PCR
检测试剂

HCV
反应液
A
HCV
反应液
B
阴性质控品

质控品

HCV
强阳性质控品

HCV
临界阳性质控品


规

格

200 ul/
管

5 ml/
瓶

3 ml/
瓶

100 ul/
管

270 ul/
管

30 ul/
管

200 ul/
管

200 ul/
管

200 ul/
管

数

量

1
2
1
1
1
1
1
1
1
7.
操作步骤

7.1
试剂准备（试剂储存和准备区）

7.1.1
进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检验流程 记录表上做
相应记录。

7.1.2

PCR
反应液配制

7.1.2.1
取出
HCV
反应液
A
、
HCV
反应液
AB
，室温溶化后振荡混匀，8000rpm
离心数秒后使用。

7.1.2.2
取出
N
个（
N =
待测样本数
+ 4
个
HCV
阳性定量标准品
+HCV
强阳性质控品
+HCV
临界阳性
质控品
+
阴性质控品
+
空白孔）
PCR< br>反应管，
HCV
单人份扩增体系配制见表
2
：

表
2



PCR
反应液配置表

组分

用量
/
人份

HCV
反应液
A
27 ul
HCV
反应液
B
3 ul
总体积

30 ul
将各组分充分混匀，
混合 好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，
之后将
30 ul
扩增体系
分装到
PCR
反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备 区。

7.1.3
75%
乙醇配制：取
2.25 ml
的
DEPC H
2
O
，加入
6.75ml
的无 水乙醇，振荡混匀，配制成
75%
乙
醇，盖紧盖子，经传递窗传递到标本制备区。
7.2 RNA
提取（标本制备区）

7.2.1
进入标本 制备区，从传递窗中取出
PCR
反应管和
75%
乙醇，放入标本制备区冰箱冷 藏。

7.2.2
从冰箱取出待测样本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控 品、
RNA
提取液
A
、
RNA
提取液
B
和 内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。

7.2.3
打开金属浴，调节温度为
65
℃，使仪器自动升温。

7.2.4
用镊子夹取
n
个
1.5 ml
灭菌离心管放于安全柜内离心管架上。
（
n=
待测样本数
+ 3 =
待测样本
数

+HCV
强阳性质控品
+HCV临界阳性质控品
+
阴性质控品）

7.2.5

向离心管中各加入
10 ul
内标溶液，再分别加入
200ul
样本，
800 ul RNA
提取液
B
，盖紧管盖，
振荡混匀
15s
以充分混匀，室温放置
5min
（每隔
1min
旋涡振荡
5s
，使裂解更充分，处理结束 后瞬
时离心。
）

7.2.6

加入
200 ul
无水乙醇，
盖紧管盖，
漩涡振荡混匀
15s
以充分混匀，
瞬 时离心，
再加入
20 ul RNA
提取液
A
，漩涡振荡混匀
5s
，室温静置
1min
。
8000 rpm
离心
1min
，小心吸弃上清。

7.2.7
再加入
200
ul
RNA
提取液
B
，盖紧管盖 ，充分混匀（用移液枪吹打）
，室温下
8000
rpm
离心
1min
，小心吸弃上清。

7.2.8
加预冷的
75%
乙醇
400ul
充分混匀，
8000 rpm
离心
1min
，小心吸弃上清。

7.2.9
加预冷 的
75%
乙醇
400ul
充分混匀，
8000 rpm
离心
1min
，小心吸弃上清。

7.2.10
打开管盖，
放入金属浴，
65
℃干燥
5 min
，使液体挥发完全。

7.2.11
温育
5min
后，用镊子从金属浴中取出离心管，加入
50 ul DEPC H
2
O
，用移液枪吹打混匀，室
温静置
1min
后，
8000
rpm
离心
1min
。离心管内的上清液即为病毒核酸溶液，建 议立即使用，如需
保存，置于
-70
℃。

7.2.13
取出已分装好的
PCR
反应管，向对应编号的
PCR
管中加入处理好的的样品 （包括待测标本、
阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各
20 ul
，空白对照不加模板，盖紧反应管。
8000rpm
离心数秒，
经传递窗移至扩增检测 区。
（用移液枪小心吸取上清液，
尽量不要碰到底层沉淀。
）