家用净水器品牌排行榜抗CD28抗体协同刺激增强抗CD3抗体体外激活T淋巴细胞并降(精)

2021年1月18日发(作者：狄生)





抗
CD28
抗体协同刺激增强 抗
CD3
抗体
体外激活
T
淋巴细胞并降低
TGF-
β
的
表达
(1)





】

为了探讨体外激活
T
淋巴细胞的方法及活化后
T
淋巴细胞的免疫学特征，利
用抗
CD3
、抗
CD28
抗体在体外刺 激健康人外周血单个核细胞
PBMNC
，检测淋巴
细胞转化，
CD8 CD25
细胞比例和肿瘤生长因子
β
（
TGF-
β
）表达 等相关免疫
学指标。结果表明，在抗
CD28
抗体的协同作用下，抗
CD3< br>抗体的刺激活性明显
提高，
CD8 CD25
细胞比例明显增加，
TGF-
β
的表达下调。结论：

抗< br>CD28
抗
体协同刺激可以提供第二信号，使
T
淋巴细胞充分活化，< br>TGF-
β
表达水平明显
下降

【关键词】

抗
CD3
抗体



Anti-CD28 Antibody Costimulation Enhances Anti-CD3 antibod
Activating T Cells and Lowering TGF-
β
Expression in Vitro


Abstract In order to study how to activate T cells and their
immunological characteristics
，
the anti-CD3 and anti-CD28 McAbs were
used to stimulate PBMNC
，
then their related immunological changes
，
such as lymphocyte transformation function
，
the percentage of CD8
CD25 cells and




TGF-
β
expression were delected by lymplocyte transformation
assay
，
flow cytometry and RT- PCR respectively. The results showed
that in costimulation with anti-CD28 antibody stimulathetion
，
the
activity of anti-CD3 antibody was significantly enchanced
，
the ratio
of CD8 CD25 cells of T cells was obviously increared
，
while TGF-
β

expression was down-regulated. It was concluded that the anti-CD28
antibody costimulation could provide stimulatory signal Ⅱ，
which
make T cells more active
，
while the expression of TGF-
β

significantly down-regulated.


Key words anti-CD3 antibody; anti- CD28 antibody;TGF-
β
;T cell





T
淋巴细胞在人体免疫系统中扮演重的角色，其在体内处于抑制或耐受状态会导致免疫力下降，从而引起感染与肿瘤等发生。近年来人们一直探讨
体将外诱导活化的T
淋巴细胞用于过继免疫治疗。
T
细胞活化需
TCR/CD3
识 别
APC
表面的
MHC-
肽复合物提供的第一信号以及
CD28/B 7
、
LFA-1/ICAM-1
等协同
刺激分子相互作用提供的第二信号。目 前国内外多用抗
CD3
抗体体外激活
T
细
胞，将
CD8 CD25
杀伤性
T
淋巴细胞回输治疗免疫力下降引起的感染与肿瘤
［
1
，
2
］。但是研究表明，
T
淋巴细胞在接受第一信号之后，如果 不能接受第
二信号的刺激，则将迅速呈低反应性或失能。在抗
CD3
抗体体外激活T
淋巴细
胞的同时，提供第二信号对
T
淋巴细胞的活化以及后续的体内回 输治疗具有重
意义。
T
淋巴细胞表面的协同刺激分子
CD28
与其配 体
B7
的相互作用是为
T
淋
巴细胞活化提供第二信号的主途径之一， 近年来已有报道利用抗
CD28
抗体协同
抗
CD3
抗体体外扩增活化
T
淋巴细胞［
3
，
4
］。






抗
CD3
抗体刺激
T
淋巴细胞后， 会介导
T
淋巴细胞分泌
TGF-
β
。近年
来研究提示，TGF-
β
在介导体内长期免疫耐受的过程中起着关键性作用［
5
，6
］。作为一个有效的免疫抑制因子，
TGF-
β
可使肿瘤细胞逃避宿主 的免疫监
视，成为肿瘤的一道屏障，这可能是过继性免疫治疗肿瘤后易复发的一个重原
因［7-9
］。






本研究在抗
CD3
抗体体外模拟
T
淋巴细胞活化的第一信号的同时，利
用抗CD28
抗体模拟第二信号协同激活
T
淋巴细胞，增强了抗
CD3
抗体体外活化
T
淋巴细胞的功能；与此同时，研究发现在抗
CD28
抗体协 同刺激下
TGF-
β
的
表达水平出现明显地下降。



材料和方法



材料



人外周血取自体检合格的献血者。人淋巴细胞分离液（比重
1.077±0
.002< br>）购自
Amersham Bioxciences
公司。抗
CD3
单 克隆抗体、抗
CD28
单克隆抗体由军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室提供。
FITC
标记
的抗
CD8
、
PE
标记的抗
CD25
抗体购自
Becton Dickinson
公司。
3H-TdR
购 自中
国原子能研究所。
RPMI 1640
培养液购自
Gibco
公司。
TGF-
β
ELISA
检测试剂
盒购自
Becton Dickinson
公司，
TrizoL
购自
Invitrigen
公司。



方法



PBMNC
分离



取正常人外周血，用肝素钠抗凝，生理盐水
2
倍稀释后小心加入等体积的< br>淋巴细胞分离液（
ρ
=1.077g/mL
），2 500×g
离心< br>20
分钟，取中间单个核细
胞层，生理盐水洗
2
遍，用含
10 % FCS
的
RPMI 1640
培养液制备成浓度为
1×106/ml
的单个核细胞悬液备用。



淋巴细胞转化试验



分离人外周血单个 核细胞（
PBMNC
），调整细胞密度为
1×109/L，加入
96
孔板，
100
μ
l/wall
。加入相应浓度的
CD3
抗体（
2
μ
g/ml
）、
CD28
抗体（
5
μ
g /ml
），设三个复孔，并设
PBS
阴性对照孔，于
5% CO2
、 37℃培养
56
小
时。加
3H-TdR
（
1 mCi/ml
）
0.5
μ
Ci/wall
，继续培养
16
小时 。收集细胞并
于液体闪烁仪上计数
cpm
值。计算刺激指数（
SI
）
=
（实验组
cpm
值
-
本底值）
/
（阴 性对照组
cpm
值
-
本底值）。



细胞亚群的
FACS
分析



收集
PBMNC
，用含
2% FCS
、
0.2 g/L
叠氮钠的
10 mmol/L PBS
洗
3
次；加
入 相应抗体，以
PBS
为阴性对照，冰浴振荡
30
分钟；

3 400×g
离心
30
秒，
收集细胞，将细胞洗
3
遍后用10 g/L
的多聚甲醛固定。用
FACS Calibur
流式
细胞仪检测分析。



RNA
的提取




收集
PBMNC
，
PBS
洗涤记数。按
1×106/ml
浓度细胞加入
Tr izoL
，剧烈震
荡裂解细胞。室温静置
5
分钟后，每
1ml TrizoL
加入
0.2 ml
氯仿，剧烈震荡
15
秒，室温静置
10
分钟。将
Eppendorf
管置于高速台式冷冻离心机，4℃，
13
400×g
离心
15
分钟。小心吸取上层液相置于另一无菌
Eppendorf
管中，加入
等体积异丙醇，室温沉淀
10
分钟。4℃，13 400×g离心
10
分钟，弃上清，沉
淀用
75
％乙醇洗涤
1遍，沉淀的
RNA
在室温自然干燥。用
30
μ
l
无< br>RNA
酶的
DEPC
水重悬干燥后的
RNA
。电泳分析以及分 光光度计定量，用于下一步实验或
-
70℃长期保存。



cDNA
逆转录



取约含
1
μ
g
稀释的
RNA
溶液，加入
Oligo(dT) 1 < br>μ
l
，70℃孵育
5
分
钟，迅速放入冰中冷却，依次按说明书 加入
2.5 mmol/L dNTP
、5×反转录缓冲
液、
AMV
反转录酶、
RNA
酶抑制剂，
DEPC
水。将上述反应物混匀后，42℃反应
60
分钟，95℃ 5
分钟灭活反转录酶，获得的
cDNA
置
-
20℃保存备用。



TGF-
β
表达水平的半定量
PCR
测定



利用
Biosun
核酸分析软件，分析
TGF-
β
基因的全序列，获得特异性的区
间，设计特异性的引物。取等量的各组
cDNA
为模 板，以
GAPDH
做为内参照，用
半定量的方法测定
TGF-
β的表达水平。
PCR
条件如下：94℃预变性
5
分钟后；
开始下 列循环：94℃变性
30
秒，55℃退火
30
秒，72℃延伸
30< br>秒，扩增
30
个
循环；最后
72℃延伸
7
分钟。2%
琼脂凝胶电泳分析，利用
Labworks
软件对
PCR
结 果条带进行灰度分析，以内参照
GAPDH
为对照，计算不同抗体条件刺激下的
TGF -
β
的表达情况。
















作 者：骆群，吕明，于鸣，黎燕【摘】为了探讨体外激活
T
淋巴细胞的方法及
活化后T
淋巴细胞的免疫学特征，利用抗
CD3












本篇论文是 由
3COME
文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站
的，论文版权属原作 者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否
者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联 系我们。



细胞培养上清中
TGF-
β
水平的
ELISA
分析



按说明书的操作步骤，将
TGF-
β
抗体溶解于包被液 （碳酸盐缓冲液
pH
9.6
），浓度为
4
μ
g/ml
，
100
μ
l/wall
包被
ELISA 96
孔板，4℃过夜后，用
10 g/L
的
BSA 37℃封闭
2
小时，用
PBST
（
PBS 0.1%
吐温< br>20
）洗涤
3
遍；按
100
μ
l/wall
加入各条件刺激下的
PBMNC
细胞培养上清，37℃孵育
1
小时，用
PBST
洗涤
3
遍；按
100
μ
l/wall
加 入
biotin-
抗
TGF-
β
抗体，37℃孵育
1
小
时，
PBST
洗涤
3
遍；
avidin-
辣根 过氧化酶
(a-HRP)50
μ
l/wall
，室温放置
45
分钟，
PBST
洗涤
5
遍。
OPD
显色，于
49 2 nm
处测吸收值；以标准的
TGF-
β
做
标准曲线，计算各培养 上清中
TGF-
β
含量。



统计学处理



应用
SPSS
软件分析结果，数 据用均数±标准差（x±SD）表示，组间比较
采用配对
t
检验，
P<0.0 5
为有统计学差异。









结果



抗
CD28
抗体 协同抗
CD3
抗体激活
T
淋巴细胞



3H-TdR
掺入实验结果显示，抗
CD3
抗体在体外可以激活
T
淋巴细胞，其刺
激指数为
16.1
。单独的抗
CD28
抗体 没有明显的刺激活性；但是在抗
CD28
抗体
的协同作用下，抗
CD3
抗体的刺激活性明显提高，其刺激指数达到
25.9
（表
1
）。
T able 1. Enhancing effect of anti-CD3/28 on lymphocyte
transformation activity (SI) (
略
)


抗
CD28
抗体协同抗
CD3
抗体增强淋巴细胞转化活性



在实验浓度的抗体刺激后，收集细胞，分析激活后的细胞中
CD8 CD25
细
胞亚群的变化。结果显示，抗
CD3
抗体刺激后的细胞中
CD8 CD25
细胞由
PBS
对照组的
3.98±0.23%增加到
12 .3±2.36%；而单纯的抗
CD28
抗体却没有明显
的淋巴细胞转化功能（4.0 3±0.95%）；但是，在抗
CD28
抗体协同刺激作用
下，抗
CD3抗体的淋巴细胞转化功能显著提高，协同刺激后
CD8 CD25
细胞所