保护自己低浓度H2O2对HL┐60细胞增殖的影响

2021年1月17日发(作者：邬员)
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低浓度
H2 O2
对
HL
┐
60
细胞增殖的影响


作者：雷建军，海春旭，曹云新

【关键词】
,
过氧化氢



关键词
:
过氧化氢
;
白血病，早幼粒细胞，急性
;
细胞周期



摘

要
:
目的

探讨低浓度
H2 O2
对同步化处理或未经处理的
HL-60
细胞作用的时间效应关系
.
方法

将培养的
HL-60
细胞进行同步
化处理或取对数生 长期细胞，施加不同浓度梯度的
H2 O
2
影响，作细胞计数，四唑盐（
MTT
）比色试验检测细胞生存率，
流式细胞技术测定细胞周期分布
.
结果

低浓度
H2 O2
作用组
HL-60
活细胞数明显高于未施加影响组，
尤以
H2
O2
终浓度为
2
μ
mol
L-1
组
作用明显（
P<0.01
）
，细胞周期也有轻度改变
.
结论

低浓度
H2
O2
作用
HL-60
细胞可使细胞数增加，其影响有时间效应关系，机制可能
同其影响细胞周期有关
.


Keywords:hydrogen peroxide;leukemia< br>，
promyelocylic
，
a-cute;cell cycle


Abstract:AIM To investigate the effects of hydrogen
per-oxide
on
human
leukemic
cells
（
HL-60
）
in
vitro
，
and
illus-trate
its
possible
S
Cultivated
HL-60cells
of
synchronization
or
non- synchronization
were
affected by different concentration of hydrogen
the number of living cells was recorded and the vitality of
HL-60cells
was
measured
by
MTT

cycle
distribution
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was analyzed by DNA flow S Com-pared with the
control
group
，
the
number
of
HL-60cells
af-fected
by
low
concentration
of
hydrogen
peroxide
was

effect
on
the
Group
of2
μ
mol
L-1
was
espe- cially

cell
cycle
changed
┐
SION Low concentration of hydrogen
peroxide could in-crease the number of HL-60living
main mechanism might probably be involved in the change of the
cell cycle.


0
引言



关于自由基、活性氧对机体损害的机制一直是研究热点
.
自从
1981
年美国学者Larry
［
1
］

提出假设
:
“活性氧含 量高低
具有调控细胞分化或分裂作用，
主要同染色体氧化损伤有一定的关系”
后，许多 学者对此做过一定的研究工作，发现机体中自由基含量和自
由基反应启动速率变化都可控制与细胞增殖有 关的代谢过程
［
2-4
］
.
国内关于自由基的研究多集中在其损伤 作用、引发凋亡、组织中含量
测定及其清除剂方面，在低浓度活性氧介质对经同步化处理或未处理
细胞的影响方面报道很少
.
本试验以不同浓度梯度的
H2 O2
作用人早
幼粒细胞
HL-60
，探讨其对活细胞的影响及其机制
.


1
材料和方法



1.1
材料



人白血病
HL-60
细胞系由第四军 医大学西京医院血液科实验
室惠赠
.
过氧化氢（
H2 O
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2
）西安试剂厂产，
-4
℃避光保存
.
临用前以三蒸水稀释成所需
浓度，试验组加入不同浓度梯 度的
H2 O2
溶液（简称
H2 O2
组）
，对
照组加 入等体积三蒸水
.
台盼蓝、
4-
硝基唑蓝（
MTT
）购自华 美生物有
限公司
.


1.2
方法



1.2.1
细胞培养



HL-60
细胞常规培养，
培养液为含
100mL
L-1
小牛血清，
青、
链霉素各
1
×
105 u L-1
的
RPMI-1640
，隔天换液
.


1.2.2
细胞计数测细胞存活率



取对数生长期 细胞，置
4
℃冰箱
4h
，使细胞低温同步化后取
出，立即施加不同浓 度梯度的
H
2
O
2
溶液，浓度范围
0.1
μ
mol
L-1
至
10mmol
L-1
，设阴性对照，
37
℃温育.
取处理后不同时间点终止培
养，
4g L-1
台盼蓝溶液染色，计数活细胞和细胞总数
.


1.2.3
四唑盐（
MTT
）比色法检测细胞活力



取对数生长期细胞，调整细胞密度为
5
×
10 5 mL-1
，以 每
孔
0.2mL
接种
96
孔板，共五板，
37
℃，
50mL L
-1 CO
2
孵育
.
次日晨每 板分
12
个组，
每组
8
个平行孔，
按不同终浓度
分 别加入
H
2 O
2
溶液，浓度梯度如下
:0.01< br>，
0.1
，
1
，
2
，
5
，
10
，
20
，
50
，
100
，
1000< br>μ
mol
L-1
，
无
H2
O2
组，
单纯培养基组
.
五块板分别于
0
，
1
，
2
，
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3
，
4d
取出，加
5g
L-1
MTT
溶液
20
μ
L/
孔，
37
℃温育
4h
后吸 取上清，
加二甲基亚砜（
EMSO
分析纯）
150
μ
L，震荡
10min
，使紫色结晶物充
分溶解，用酶联免疫计数仪，波长为
490nm
，测定各孔吸光度
.


1.2.4
细胞周期
DNA
分布测定



取对数生长期细 胞，无血清培养液培养
24h
使细胞同步化，
离心去除无血清培养基，加入含
100mL
L-1
小牛血清的
1640
培养基，
稀释细胞密度为
5
×
105 mL-1
，分别加入
12
孔板，每孔容积为
2mL.
取
6
孔各施加终浓度为
2
μ
mol L-1
的
H2 O2
溶液，另
6
孔各加入等
体积三蒸水
.37
℃，
50mL
L-1
CO2
孵育，于不同时间 点（
0
，
2
，
6
，
12
，
18< br>，
24h
）
同时取施加影响组和阴性对照组各一孔细胞，
置两只离心管
中以
800r min-1
离心
5min
，
PBS
洗两次，弃上清，
700mL L-1
乙醇
固定，
4
℃存放待测
.
测定时离心去上清，< br>PBS
洗涤
2
次，加入碘化丙
啶，避光染色
15min
，
FACSPLUS
流式细胞仪进行细胞周期测定
.

统计方法
:
结果以本校卫生统计学教研室统计软件
SPLM
作重复测量方< br>差分析［
5
］
.


2
结果



2.1
细胞计数



低浓度剂量
H2 O2
（
1
μ
mol L-1
）作用
HL-60
细胞后，光
镜下观察见细胞外形规则，边缘光滑，折光性好 ，死亡细胞很少，增
殖活跃，活细胞数明显较空白对照组多
;
中等浓度剂量
H 2
O2
（
100
μ
mol L-1
）作用
H L-60
细胞后，
3h
可见少许变形细胞，外形不规则，
有长条形状，细胞轮 廓尚在，可见一些细胞碎片，
12h
活细胞数降至