李少芬如何防止霉菌生长

2021年1月16日发(作者：柴贞仪)
生物迷：介绍点我的经验：真菌大多悬浮于液体表面
,
如果发现有少量真菌污染可用< br>大量
PBS
或
D-HANKS
冲洗
,
加含有双抗的培 养基培养观察
3
天
,
然后看有没有真菌
.
我用
这种 方法救了一瓶非常宝贵的细胞
(
用
GIBCO
胎牛血清外加
FGF- 2
培养了一个月的
MSC).
seaman_wang
：如果你霉菌污染， 有两种方法，一种是你制备一些小鼠的饲养细胞
加入板上，
一起培养，让饲养细胞中的巨噬细胞 吃到霉菌。第二种，在培养基中加入制菌
霉素。

PINX
：是真菌污染，可 以用两性酶素
B
试试看，不要用国产的，因为试剂不纯，有
较大毒性，
GIB CO
有商品化的两性酶素，我师妹用过效果不错。

heimukai13
： 请问
:
我先配置
DMEM,
然后过滤
,
吸
3ml< br>检菌三天
,
若无菌
,
添加
FBS
和
双抗,
过滤后贮存备用
.(
不知这样对否
?
因为我是从别的实验室学 的
,
我连续几次配
,
检菌时
都发现培养基表面有一层薄薄的如雪花形 状的东西
,
它在配完培养基第二天下午六七点还
看不到
,
而到九十点 就能看到好多
,
非常迅速
,
但往后几天却又不怎么长了
,
培 养液一直是清
澈的
,
很纳闷
,
不知是什么东西
,)
若配置
DMEM
后不检菌
,
而直接加
FBS
和双抗
,
成为全培养基
,
过滤备用
,
可以吗
?
asd 1191
：双抗要在配
DMEM
时就要加，然后过滤！过滤后最好在
DMEM
中加一
点血清在培养，
这样长菌的话快！过滤前是不加血清的，
因为血清是很 难过滤的！
培养基
表面的如雪花形状的东西可能是长菌的，
你摇晃一下瓶子，
若浑浊了，
则很有可能污染了！
另外培养基最好不要反复过滤！这样营养成分会丢失的！另外反 复过滤的话会偏碱！

heimukai13
：哦
,
原来要先加双抗 的
!
加了双抗
,
还需要检菌吗
,
我想一般就生不了细菌了吧
!
我不加血清都有漂浮物了
,
会不会是真菌呢
,
是 的话
,
怎么防止呢
?
那些雪花状的东东
,
摇一下
,
还是在表面荡来荡去
,
培养液清澈
.(
见图
)
我过 滤加
FBS
后的培养液很好过滤的
!
怎
么回事呢
?

hualey
：加双抗也只是防止一般染菌，但像支原体等污染就很难起作用，所以 加了
双抗之后还是要验菌的。感觉你那东西像染菌，因为
1
）你没加双抗；
2
）开始没有，第
二天才出现（除非你的培养基
pH
发生大的变化，一般不可能 ）
。鉴于你每次都出现这种
情况，
你是否可考虑环境或操作有问题，
你也没说 具体，
所以只能作为建议。小牛血清不
好滤是相对的，
我滤过小牛血清，
只是 比不加血清的培养基难滤，
有时含血清培养基用久
了，我还用滤器滤过呢！

heimukai13
：
我第一次配时没有发现这种情况
,
后面三次操作都一 样
,
而且用的都是刚
灭过菌的东西
,
而出现照片上这种东西了
,
会不会是培养液里的氨基酸什么的析出来了呢
,
因为这雪花样东西过上几天还是这 么多
,
是菌的话应该长疯了吧
!
而如果是支原体的话
,
应< br>该肉眼看不见的了
.
scp
：应该不是氨基酸析出，若是氨基酸析出的话沉淀 是在底部的。漂浮在上面会不
会是霉菌呀？你有没有用这种培养基养过细胞呀？不妨尝试一下看看有没有 污染，
如果没
有污染的话，
大可继续使用。
还有。
双抗一定要在过滤 之前就加上，
血清最好也是这样
（虽
然过滤速度会慢一些）
。
heimukai13
：应该不是霉菌吧
,
霉菌是丝丝连连的
,
绒球球样
,
长起来好多就悬浮在培
养液里了
,
有一瓶细胞曾经污染过
,
这个就不一样了
!
我试试看用它来培养细胞
!
朱晶：< br>：
双抗一定在要滤之前加，
对于
DMEM
培养基我建议在
-2 0
冻存后，
如果想用
最好提前一天化出来，放到
4
度里放一天再用， 这样比较好，因为这种培养基极愿意产
生一些析出物，
放置一天会就会溶开了。
而且我 觉得血清最好还是不要过滤，
里面含有一
些大分子的营养成份，如果过滤的话对血清本身来说是 一种损失。

szmengjie
：我第一次培养
T
淋巴细胞，加了
PHA
刺激其生长。发现显微镜下它们
长得特别快，
昨天还是密度适中的圆圆 ，
亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。
细胞中间有些
聚集成团的颜色较深的象一堆血小板 一样的东西。
今天一看，
已是长得平铺了一视野的密
密麻麻的看不出单个细胞的形态， 大小。呈向心性分布，即中间密度尤高，而越到边缘，
则稀疏点。
在稀疏处可看到圆圆，
亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。
肉眼培养液里有白色
絮状物。白色絮状物究竟是污染还是细 胞数太多？

菊花与刀：是不是霉菌感染呢，我前段时间培养的细胞最后就是感染霉菌了，就是
一团一团的漂在上面，中间密度高，周围稀疏，高倍镜下可以看到菌丝。

szmen gjie
：我想霉菌污染是有可能，我用的是
24
孔培养板，因为标本是断断续续地来 ，
一次只能用其中几个，将那些细胞悬液吸走后，因还有没用过的孔，舍不得丢掉培养板。
过一 天，看那些曾用过的孔，孔底部长出象雪花一样的，
也可说象海藻一样，每个枝象细
胞生物学上 分子筛的图像一样。我想问：
1
细胞太多能出现白色沉淀吗？
2
霉菌污染 除
开看到菌丝，
还有其他方法证明其存在吗？早期有什么补救措施吗？
3
我对 细胞培养时出
现的污染实在没有概念。有没有哪里提供图谱，让我们这些新手认认敌人的面貌呢？


culture- spirit
：
1
、可以，镜下可见此处细胞程大团分布

2
、如果霉菌污染已经到了出现白色沉淀的时候，一般能够看到菌丝了，镜下相当明
显

3
、这个我也没有找到，好象一些细胞培养的书付页里有，可以请教其他战友

qjzhou2000
：

1
、不会是

沉淀的， 仔细看应该还是可以看到细胞形态的，你用的是不是
olmpus
的相差境？那种倒置境的相差 效果很好，细胞看起来有点象珍珠。

2
、霉菌看到菌丝的时候就很厉害了，早期不容 易发现，可以加两性霉素之类的抗霉
菌的抗生素，具体请在该区搜索，很多都讲到了。

3
、现在还没找到，不过一些描述还是很直观的。

midas
：细胞数太多会出现片状的脱落，所以白色絮状物污染的可能性大些！
< br>独上高楼：霉菌污染后细胞多生长很慢，象你这种情况，细胞一夜就长满，霉菌污
染的可能性不大 。
另外，
霉菌污染也不能一下就看出白色絮状物，
而是先在镜下看到较稀
少的 短小黑色分枝串珠，
再看到较密集的短小黑色分枝串珠，
最后才能肉眼看到白色絮状
物 ，这个过程大约要
1
个星期左右，而且在这期间细胞几乎不生长。

szme ngjie
：
前段时间我老被这种在细胞培养液中白色的象一片白膜的东西困扰。
40
倍镜下同
“
细胞污染讨论区
”
贴出的图片一样。上周我送了个培养， 结果证实是真菌污染。
显微镜下（
100
倍油镜）染色后可见到一颗颗象红色的南瓜子 一样的东西（真菌孢子）
。
据细菌室的老师说还可在这些
“
红南瓜子
”
间见到丝一样的东西。可能就是菌丝了。

我已经非常注意实验器材的消毒灭菌，操 作应该也没问题。于是将试剂一个一个吸
取了放在显微镜下观察，发现是洗细胞的
HANK'S
液被真菌污染了
!
现在我已经换了
HANK'S
液，这种污染可以说 被控制了。

yoyo781206
：我想应该是污染了，因为我也遇到过，过几天就 看到放射状的菌丝了

topgun
：象霉菌的菌丝，但应该观察其数量是否增多？因 为霉菌污染在
2-3
天内可
见大量的菌丝！如果是不小心带进去的棉絮则不会有数量的 增加且培养基也不会变混浊。

yuandong
：我想应是霉菌，白色，絮状，培养基变成了黄色。

ap ple800828
：不象霉菌污染。前两天我培养的内皮细胞被霉菌感染了，好典型的
树枝分 叉样。象抽丝一般。

chenting100
：是霉菌，我们的细胞就经常出现这种 污染，实验室老师说霉菌有好多
种变异呢。

huvec
：其中有多细胞真菌污染的特征性标志：菌丝！

wujingh ui
：我得细胞培养液中不知道是什么东东，它漂浮生长，在瓶底是白色的，在低
倍境下就能看 到，在培养瓶里边呈葡萄状，还有的呈树枝状，
刚开始时候生长的不快，
但
是很快就长 得很快。
不知道这个东西是什么东西，
英文名字怎么写，
最好能告诉以下如何
控制！


ya2cyto
：霉菌感染。霉菌是以孢子在空气中传播，细胞肯 定是不能要的了，一旦污
染很难控制

用环氧乙酸熏蒸培养箱，最后再对培养箱进行无菌实验方可使用

wujinghui
：
不是霉菌，
因为霉菌不用显微镜就能看得到的

。
我这个不用显微镜是看
不到。

shyaroom
：不信 ？你再放个三天，肯定就能用肉眼看到啦，呵呵。不过建议你换个
地方放，别把其它细胞再给污染了。< br>
ylh1976
：霉菌，树枝状的东西是菌丝，葡萄状是霉菌。赶紧处理掉细胞，培养 箱、
操作台还有整个培养室好好消毒一下。梅雨季节要千万小心，空气中到处都有霉菌孢子。

深谷幽兰：各位，有时鸡胚成纤维细胞也连在一起，呈树枝分叉状，而正常的细胞
单个散在，这 是怎么回事？

junny999
：我的一个同事养的细胞被霉菌污染，我与她共用一 个培养箱，为防止交
叉污染，我想在我的培养基里加点抗霉菌的药，请教加哪一种药物比较好？剂量怎样 添
加？我养的是
MSC
XTYang
：
Invitrogen
公司的
Fungizone, 1%(v/v)
的用量。对有些细胞有毒害作用。

renjiaqiang
：我觉得你最好不要加，我加过抗霉菌药物后细胞生长很慢，而且形状
也发生改变，
不得已重新 买了一株细胞，
你现在可以先把细胞冻存，
将培养箱消毒后继续
进行实验。

lingzhiting
：最好不要用吧！我用过
nystatin
，
40Iu/mL
。霉菌没长起来，不过也许是
不溶的缘故，细胞生长很慢，而且还引入了不明 杂质，洗了几次，才逐渐洗去。

wuguojun680510
：
如果没有 长真菌就不要加抗真菌药物，
因抗真菌药物有较强的细
胞毒性，加了结果会适得其反。最好能把 环境处理一下。

qianyimei
：星期一复苏了一支细胞株，养到星期三还好好 的。心太急。老希望它能
长的快些，所以，将一瓶配成三瓶用，结果倒好，今天早上一来，就发现里面长 了很多成
团的碎片状的东西，
众师兄都说是霉菌，
叫我倒掉，
好可惜，
好郁闷！
早知道就不换液了，
这一换，全军覆没。那位能有更好的办法吗。

zhaoqingshan
：
用含双抗的
PBS
洗几遍，
换上好的 培养液
（比如用点好的胎牛血清）
；
每天洗
1-2
次，只要细胞状态 还好，洗几天，就能把霉菌去除。然后，检查霉菌污染的原
因，清除污染源。
zjuaxiu< br>：根据经验霉菌污染了用双抗的
pbs
冲洗基本是没什么作用，
只能是浪费双抗
pbs
时间

zhaoqingshan
：那只是说明你的经验，不 巧的很，我的细胞
(
细胞很娇贵，培养液价
值约
10
元
/m l)
去年七月霉菌污染了一次，全部抢救过来。不可否认很多时候是抢救不回
来，前提条件是早 发现污染，霉菌对细胞还没有构成太大伤害时候，是可能抢救回来的。
当然，最重要的是不要有污染了， 预防最重要，即无菌观念要强。

flyingpumc
：用
3
微克每毫升的两性霉素杀杀试试
!!!
eweiren
：如果不是唯一的一管细胞，我觉得没有必要费这么大力气去挽救，因为有了霉菌，
基本上是无法去除的，
通过换液只能达到抑制真菌的生长，
在镜下看不到 不代表
不存在，只是由于少或者芽孢看不到，一段时间后它可能还会出来，耽误试验啊！

zhaoqingshan Re:
碧海娃娃

双抗
PBS
是指含有双抗
(
青链霉素
)PBS
（磷酸盐缓冲液，也不能杀死霉菌，杀霉菌 应该
用两性霉素或制霉菌素）
，使用双抗
PBS
冲洗仅仅是预防其它细菌的污 染而已。


Re:eweiren
，你说的是很对的，真正严格的实验是不应该有污染的。

细胞株拿来后，传代几次， 细胞多了，就应该冻存一些，一方面以免细胞传代次数
多了变成非二倍体或者其它变异，
另外就 是以防污染。
如果自己培养的原代细胞，
可以挽
救一下试试，大部分情况是难以回天的 ，看运气了。

不过，我那次污染正是霉季，一般实验室在这个时候，可能就不养细胞了，我们 实
验室是我们院里无菌观念最严格的一个实验室，
在这以前，
细胞从来没有污染过。< br>那时候
可能是因为空调很久没有擦洗消毒了，而我又太大意，因此感染霉菌了。不过，那次我还< br>真的就救回来了，因为我的培养液中，营养条件特别好，而且我每天洗几次，换液，细胞
没有任何 的受影响的表现，
我做的是原代细胞传代到第三代，
刚好该做实验，
因此就全部
用来做了同一批的实验。

避免真菌污染的几个措施：

1
、严格的无菌操作
;
2
、无菌间定期打扫、消毒，保持干燥；

3
、各种培养液、培养器皿的严格消毒；

4
、温箱中消毒水中放置过饱和的消毒的磷酸氢二钠或者硫酸铜。

eyeb all
：霉菌污染了用双抗的
pbs
冲洗基本是没什么作用，只能是浪费。关键是液< br>体一定要保持无菌。培养液过滤后要取一点先放培养箱预培养三天，无菌生长后再用。

dongshiwu
：我曾经就回来过遭霉菌污染了的细胞。如果细胞好养或有存货的话，
干脆 从头作起，要是舍不得可以用
PBS
液洗
3
遍，在新的培基中加两性霉素。< br>
XTYang
：最好弃掉，要不在以后的培养基中加
Invitrogen< br>公司的
Fungizone
，多换
几次后也可。

wangf x_vet
：
我最近养的细胞总是出现空泡并且不断死光。
改变血清浓度也没有用，< br>不知道怎样解决

俺来了：是不是排出污染，比如霉菌包子感染可能这样，因为我的前面 一批细胞就
这样，培养基不混，细胞内有很多空泡，且可见一些比细胞大得多无明显细胞结构的
“
圆
形细胞
”
里面有很多小的空泡，如果是这样的话，那就是霉菌污染，但愿 你的不是，否则，
什么都得重来！

wangfx_vet
：
对对！
就是楼上老师说得那样！
那末说我的细胞是污染霉菌了！
！
！
？？？
那我就惨了，这是引进的细胞哎，没了就永远没了！没有拯救的办法吗？

hkai9 7
：霉菌污染是很烦的问题
,
试试杀霉菌的药物
.
这只能是死马当活 马医了
.
重要
的是预防
.
常做清洁和消毒
,
保持实 验室的洁净度
.
否则还会出现细胞污染
.
doctormeng
：谁知道细胞培养血清中出现黑焦虫，该怎么办？

有 没有专门对付他
的东东，
比如抗生素之类？我养的细胞中出现了：
中间一个黑黑的东西 ，
其四周包围有象
棉花样的的东西，不知是不是黑浆虫。其周围的东东，有点类似于菌落。

huiql
：我以前也遇到过这种情况，估计可能是真菌污染，慢慢地培养 液就变混了，
有人说用制霉菌素在刚出现时可以制服，
但我没有试过，
听说南方的真菌 污染和北方的不
一样，这种可能属于南方的。

义超：先需确定到底是何种微生物，可 以去微生物科做细菌培养来确定。如果是真
菌，细胞又实在很难得，可在细胞培养液中加入二性霉素D
来挽救，也许有用。

hantian
：黑胶虫好象不是诸位描述的样 子。我碰到的黑胶虫有点类似与杆状细菌，
但长度比细菌长，而且会左右摆动，甚至游动。这是血清中带 来的，不属于细菌，普通的
抑菌方法是没用的，
而且他长势很快，所以遇到这种情况只能倒掉。 也有人说，进口血清
中的黑胶虫要甚与国产血清。

ph123
：同意楼上的 意见。我亦在细胞培养中遇到同样的问题
,
胶虫成熟后呈线状
,
可
以 快速移动
,
一般由血清中带来
,
如果发作的话只有把细胞弃掉
,而且要赶快换血清。
但你描
述的情况还不能肯定是胶虫
,
可以通过培养< br>,
在油镜下观察一下
,
看是否是污染
.
另外如果
你 观察到的情况没有发展
,
细胞不受影响的话
,
亦可能是血清中的纤维蛋白沉淀
.
icesugar75
：
As far as I know, the black cluster is mostly
霉菌
, since I encountered
it before. But you could know it quickly if it is
霉菌
, becaue
霉菌

is growing very fast,
finally showing up in unclear appereance
csdoctor
：听协和基础所的陈实平老师说，她并不认为真有什么黑焦虫。


icesugar75
：一般霉菌很难控制，一天或是两天就长起来了。如果刚刚怀 疑有霉菌，
加双抗可能会好使，
但说实话，
刚刚开始要想判断是不是霉菌真是太难了，
当时的霉菌类
似死细胞，两三个小团在一起，暗的，如果不是特别有经验，很难说是不是。所以 如果发
现有小黑点，取出一点放入
37
度培养箱中一天就知了，而把余下的血清冻好。 如果运气
好，双抗会管用，不好就扔了吧。

lim99011
：双抗好像对 霉菌没有用吧
?
我好像记得霉菌用的是两性霉素
,
双抗没有作
用的< br>.
zzy8896
：一点经验之谈！我在养
pc12
细胞时出现过这 种情况，我的细胞也是莫名
奇妙的出现，而且过几天后，细胞活力状态明显下降，最后死亡，
但 不同于一般的细菌和
霉菌。我请教了许多人，没有结果。我试用
g418
加在培养基中 ，养了一阵子，后来就消
失了，
但你要摸一下浓度。到现在我还是没有搞清楚什么原因，可以试 一下。我倾向于它
是一种特殊的细菌。

ronic
：我也觉得双抗对霉菌没 有用，加抗真菌的药试试看了，不过好像很贵，而且
细胞对它的耐受性比较差。

Yong
：建议慎用
G418
，除非你的细胞有抗性

ha ppywind
：养原代，不幸
4
天后发现多瓶惨遭霉菌毒手，有一瓶细胞贴壁挺好，
且菌丝没有沾在瓶底上，
因此我想试着救救这瓶细胞，
换液，
反复冲洗，最后再放进孵箱，
结果过了两天，
培养瓶里的细胞竟然长的挺好，
没有丝毫霉菌污 染的迹象。
难道这样也可
以！

kaize
：不知污染的细胞的一些基本特性会不会改变

chelonian
：但是这样的细胞，做实验结果可信吗

Skyhawk
：这是我们实验室细胞培养出现的不像霉菌，不像死细胞的东西，培养越
久越多，看看大家是不 是也遇见过，是什么呢？什么原因引起的？


（图：
/bbs/post/ view?bid=66&id=1650849&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1650849
）

以上图片取自转染有目的基因的
cos7
细胞 ，
是在用
G418
筛选时出现的东西，
不同
细胞都有（
ve ro
细胞也是），我的师兄和师姐都出现有类似的情况，但我的细胞没问题
（和师姐的实验目的 一样，只是我是自己另外准备培养基的）
，目前他们都挺困惑的，
希
望得到
d xyer
的帮助！？

taolt
：我感到是真菌污染，肯定不是培养液解冻 后出现的东西。我们这里配好的培
养液都先冻到－
20
度，
等用的时候再拿出 来用，
已经有
4
－
5
年了，
从来没有见过这样的
东 西。我有一次也是感染了真菌，与你的照片很相似，而且在早期并不影响细胞的生长，
甚至细胞长得速度 更快了。这可能是因为有的真菌会分泌一些能促进细胞生长的因子有
关。加些抗真菌药物，要是不重要的 细胞就扔掉吧。再看看细胞孵箱里有没有真菌斑！

Skyhawk
：我们一般都是把 培养液配成
1X
，过滤后放
4
度保存使用。所以，应该可
以排除是培 养液冻溶的问题。培养久了，
细胞生长状态不好了，但培养液没有变浑，不像
是细菌污染。真菌 污染倒很有可能。谁有类似情况的照片放上来看看？