贴错试管凝胶过滤法分离蛋白质实验报告

2021年1月15日发(作者：试管 体外受精 率 卵)
凝胶过滤法分离蛋白质
一、实验目的
了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二、实验原理
凝胶 过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本
实验使用交联葡聚 凝胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。当
其填充完成后，加入混合分子大 小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙
向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒 内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经
过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中 的分子则后于大分子而先于小分
子流出。从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。
三、试剂与仪器
0.1molL磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K
3
Fe(CN)
6
,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血
1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒
四、实验步骤
1.凝胶溶胀
2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后 加入约6cm的
缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲 液，
关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。
3.样品处理
4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。打开出
口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓
冲洗脱。
5.部分收集：控制速度为0.5mlmin左右，用试管收集洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。
6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。
五、实验现象结果及其讨论

颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的 红褐色开始变深，到最后，试管的颜
色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。接着又 开始出现浅黄色，再到
黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。
原因：1.开始时 ，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为
缓冲液。
2.红褐 色慢慢变深，是因为分子的扩散有快有慢，少量的高铁血红蛋白与缓冲液一起滴出，
使得溶液慢慢加深。
3.溶液变成深褐色，是过虑后，高铁血红蛋白的本色，颜色越深表明过虑后得到蛋白质越纯。
4.红褐色又开始变浅是因为大部分高铁蛋白已经洗脱下来，剩下少部分洗脱较慢的高铁蛋
白，所以颜 色又开始变浅。
5.开始呈现浅黄色，并又出现黄色，最后变成无色是因为高铁氰化钾的扩散快慢决定 的，少
部分扩散较快，接着大部分K
3
Fe(CN)
6
,洗脱出来， 最后抗凝全血几乎洗脱完毕。试管接收的
是缓冲液。
6.造成红褐色在前释出，接着才到黄色 ，其原因是：血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血
红蛋白，因为高铁血红蛋白的分子大，洗脱速度快而 小分子的高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，
从而造成红褐色在前洗脱出来，黄色在后。
六、思考题
1.利用凝胶层析后分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？
答：1、柱床要均匀，下口要无气泡存在。
2、上样的速度要缓慢。
3、收集时要注意柱床上总有液体。
4、收集时的流速不宜过快。
5、保持各管收集量一致。
2.凝胶过虑法在蛋白质分析中还有何应用？
答：1、 脱盐：高分子（如蛋白质，核酸，多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层
析法除去，这一操作为 脱盐。本法脱盐操作简单，蛋白质在这一过程不易变性。
2、测定高分子物质的分子量：用一系列已知 分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条
件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对 分子量的对数作图，在一定分子
量范围内可得一直线，由此直线求未知物质的分子量。
3、高 分子溶液的浓缩，通常将干胶投入到稀的高分子溶液中，这时，水分和低分子量的物
质就会进入凝胶粒子 内部孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，经离心，将溶液的
凝胶分离出去，就得到了浓缩的高 分子溶液。
4、