单核细胞、中性粒细胞分离方法及注意事项

2021年1月11日发(作者：暖宫汤有哪些)
单核细胞分离方法
将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的Ficoll Hypaque分离液表
面，以450 g离心25min收集单个核细胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培养
液悬浮细胞，置于6x 6 cm 玻璃培养皿中，在5 ％CO2 、37℃ 下孵育2 h，收
集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培养液悬浮 单核细胞，Wright
染色计数单核细胞>95％，调整细胞密度为4×10／ml。将细胞悬液加入 24孔培养
板中，在5 ％CO2，37℃ 下培养24 h，离心收集上清液，冻存于一70℃ 冰箱中
备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。
细胞分离中需要注意的几个问题
1.如果您要做细胞培养，记住实验中所用的试剂（分离液，洗涤液等）、器械等都
要是无菌消 毒的，并注意实验中的无菌操作。
2. 离心转速单位及时间：目前国外的文献报道基本上用g为单位，注意g和转速（r
pm）的换算。
3.离心温度：有的要求室温，有的要求4摄氏度。实验的操作要求尽可能熟练，连
贯。 4.在用Ficoll分离单个核细胞（PBMC）时，通常含有少量的红细胞，对于一般的实
验影 响不大，如果实验要求较高，可采取裂解液（有的需要无菌），并注意裂解时
间控制，以免影响单个核细 胞的活性。
5. 在用Percoll配不连续梯度时（一般用高渗NaCl），注意各成份体积的准 确性，
否则密度与预期的不一样，影响分离效果。
6.用全血离心效果比全血稀释后再离心效果差，稀释一般等体积稀释一倍。
7.分离液与样 本的体积比：一般应小于1：2（即一般为1体积分离液，2体积样本，
不宜超过2体积，小于2体积均 可）
8.洗涤液的成分：不同文献报道不一，有的使用PBS，有的为Hank’s，KRP等，可自己选定。主要是离子浓度及成份的不同，有的含有 Mg2+,Ca2+。
9. 细胞活性：0.2%台盼蓝染色3－5分钟，镜下观察计数死亡细胞（蓝染）。
中性粒细胞分离的方法
1、标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法 < br>1）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐
液 定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。
2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet- poor Pl
asma, PPP）。
3）余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，
并用生理盐水（0.9%）调 节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。
4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。
5）沉淀的细胞用8mlPPP- 生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。
6）悬液细胞上面加入3mlFicoll- Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。
7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155M NH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，
然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用H
BSA（含钙）重悬。
8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。
2、不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法
1）先制备Percoll储存液：P ercoll原液（100%）:0.9%NaCl的体积比为9：1。
2）取一50ml聚乙烯管， 无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐
液定容至40ml。上述全血300g X20min，离心，室温。
3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet- poor Pl
asma, PPP）。
4）余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，
并用生理盐水（0.9%）调 节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。
5）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。
6）沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬
7）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、 2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、
2~3ml细胞悬液，275gX10min .
8）单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间，中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间。血小板可通过 25%Percoll离心5min去除，也 可在原
密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除。
9）中性粒细胞层用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs- Ringer磷酸缓冲液（KRPD，
PH7.23）洗1次。
10）用这种方法可得80%中性粒细胞，纯度在95%以上。