魔术贴不粘试管婴儿人类配子胚胎与性腺常见的冷冻方法

2021年1月10日发(作者：镇江江滨医院妇产科需要提前多久预约的啊?)
试管婴儿人类配子胚胎与性腺常见的冷冻方法

在辅助生育技术中，最常见的是程序 化慢速冷冻法，其次是玻璃化冷冻，较少用
的是超快速冷冻，后两者都属于快速冷冻的范畴。冷冻技术在 不同的IVF中心
有或多或少的变化，但不同的方法都可获得较好的结局。这表明冷冻标本可以耐
受一定的外界变化，只要这种变化是在细胞可以承受的范围，则细胞可以存活，
发育潜能可以维持。

(一)程序化慢速冷冻法

通常在程序化慢冷的液 体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一
种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂 溶液中预平衡，然后
放置在终浓度的冷冻液中。在冷冻仪(图13–2)内于预设的程序下降温标本，经 过
冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自
身的特性，它 在细胞内外电解质平衡时，胞内液冰点比胞外低。


程序冷冻仪
图13–1


程序冷冻仪
图13–2



在室温到植冰点之间降温，往往
冰晶还未来得及形成，但此期可
以发生温度休克。温度休克al
shock)是指某些细胞在降温过快
时受到损伤，甚至在冷冻过程中
被破坏的一种表 现。其特点是与温度变化速率有关，常发生在15℃一一5℃降温过
程之间。这可能是由于细胞膜脂类的 相变，膜受损后渗透率改变；或在不同的热
收缩应激反应时，细胞膜结构的断裂引起的。卵磷脂被认为有 保护作用。

冷冻液通常在达到诸如一15℃的温度而冰晶尚未形成，即 处于超冷状
态。为了避免过冷状态的发展，使每一个溶液在一个特定的温度时开始冻结，使
细胞 脱水逐步顺利地进行，及为了控制过冷生物样品中过度大冰晶的形成作用，
可通过两种方法来诱发结晶： 一是向液体中加入微量冰晶，较少采。二是较常用
的植冰(seeding)：用预冷至一70℃，或更 低温度的金属棒在标本溶液冰点以下
2–3℃时，瞬间地接触样品容器，可以带走大量水在液相转化为固 相的潜伏热，
这样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。辅助生殖中常采用的植冰温度是
一 6℃一 – 8℃。目前，人工植冰比冷冻仪自动植冰可靠，用冷冻过的金属镊接触
的部位应避免标本刚 好所在位置，以免将样品迅速降温至细胞内冰晶形成而致
死，一旦看到细胞外溶液中有一个白点样的小冰 晶出现，提示溶液中已有大量冰
核形成，即应立刻移开金属镊，将冷冻管放回冷冻仪，数秒钟后如再次拿 出冷冻
管观察，则标本溶液呈白色云雾状，提示溶液中已有大量小冰品形成，提示植冰
成功。植 冰在超冷状态极容易成功，否则不易进行。当麦管离开冷冻仪时，温度
迅速上升。因此在诱导冰晶形成时 ，麦管离开冷冻仪的距离宜短，操作动作必须
快，以避免温度波动过大。其次，冷冻仪的温度必须准确而 且稳定。在诱导结晶
后，冷冻植冰后大量冰晶形成导致大量潜热的释放，所以诱导结晶后在植冰温度保留5–10分钟以达到平衡状态。植冰使溶液浓度进一步增高，细胞进一步脱水。

植冰后的冷冻速率非常重要。因为如果降温过快，则细胞内的水分来不
及脱出，造成在胞内液渗透压还来 不及增高，冰点还来不及降低的情况下，由于
外界温度明显降至胞内液冰点之下，细胞内形成冰晶。如果 降温过慢，由于胞外
溶液中的水逐渐结冰，剩余溶液的溶质浓度越来越高，细胞长时间地处于剧烈变化的外界pH和高渗透压中，将导致脂蛋白的变性而引起细胞的质膜的僵硬、收
缩和受损，这称为溶 液效应(solutioneffect)。最佳的冷冻速率应当慢到足以防止
细胞内产生冰晶；快到使 细胞置于高电解质溶液中的时间缩短到最低限度，以减
少溶液效应。


图l3–3所示：用最佳降温速率冷冻时，可得到最大的存活率，超过最佳
速率冷冻时的损伤是由于细胞 内的冰晶的形成。低于最佳降温速率时的损伤，被
视为溶液效应的结果。

植冰后，在适宜冷冻速率下，随着冷冻过程中温度的下降，围绕胞外小
冰晶将有更多的水结冰，细胞脱水 则随着溶液中的水逐渐转变为冰晶而顺利进
行。随着细胞内外水分越来越少，溶质的浓度越来越高，细胞 内、外液渐渐变为
极其粘稠的状态，此时可以将其快速投入液氮。这时，粘稠的胞内外液体立即转
化为玻璃样的固体，与先前溶液中形成的冰晶凝固为一体。胚胎投入液氮前的温
度对复温后的活力影响 极大。在采用PROH方案时，在一25℃时将胚胎投入到液
氮中保存，复温后极少胚胎存活；＿ 25 ℃一一30℃吋将胚胎投入液氮，复温后的
存活率明显低于在一80℃一100℃时投入液态者；这说明 在使用目前的冷冻器材的
情况下，只有在较低温度下，细胞内的高浓度液体才能玻璃样固化而不至于形成
大的冰晶。虽然在低于一30℃时投液氮都是可行的，但许多IVF中心选择更低的
温度，显然 是考虑到投液氮过程中标本复温，以及标本稳定性等问题。


不论 是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞造
成脱水状态，但脱水的同时不能影响到细 胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对
细胞造成的损害也是冷冻应注意的方面之一。业已证实，单纯就低 温保存而言，
影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经过冰晶形
成 和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可能毁于
过度冰晶形成。但脱水过度 ，细胞也可能死亡。理想的冷冻方案是：①找到细胞
含水过多和脱水过度之间的平衡点；②合适剂量的冷 冻保护剂，既可以取代细胞
质膜周围的水分子，又避免“溶质效应”；③合适的冷冻速率。


缓慢冷冻曲线图

(二)玻璃化冷冻


玻璃化冷冻是指高浓度、极其粘稠的冷冻保护剂溶液在快速冷冻过程中
由液态直接冻结为无结构的极其粘 稠的玻璃状态或无冰晶结构的固态，这种玻璃
状态能保持其溶液状态的分子和离子分布。我们知道，实现 溶液的玻璃化，有两
条途径：一是极其快速的冷冻速率，一是极其高浓度的溶质。然而在实际的运用中由于技术和生物毒性等问题，单独实现任何一条途径都有困难。但是两者相结
合，可以实现玻璃化 的结果。

玻璃化冷冻的步骤一般是在高浓度的冷冻保护剂短时间平衡之 后，使
用最少的液体体积、采用导热性最好的、管壁薄或无管壁的容器作为标本载体，
直接投入 液氮中，以达到最快的降温速度。是在较短的时间里完成冷冻程序的一
种简单、快捷的工艺方法。

由于标本或容器的因素，降温速率会受到一定的限制；而冷冻保护剂浓度越高对细胞伤害越大。因此，应该在最大可能地加快降温速率及减少冷冻保
护剂的浓度之间寻找 一个最佳点。另外，任何一个玻璃化基本的冷冻方案均需要
极快地经过关键的15℃一一5℃以减轻温度 休克。

如果降温的速度不够快，则有可能在同一种溶液中出现既有玻璃化 的区
域，又有结冰的区域。如果溶液没有很好的混合，造成各个部分的组成不一样但
是以相同的 速度冷冻，或者是各个部分的组成一样，但是降温的速度不一样，都
可以造成有溶液形成透明的玻璃化的 区域的局部有微小冰晶的存在。然而，其实
即使在透明的区域也可能有数不尽的冰核或冰晶的存在，因为 小于光波波长的冰
晶不但肉眼不可见，在光镜下也是不能发现的。

液氮的沸点，即气化点是一196℃。玻璃化冷冻可以在没有任何昂贵的
冷冻器材的情况下进行，但近来 AraV等人报道采用较昂贵的真空仪VitMaster
制造溅开的液氮或液氮蒸汽进行玻璃化冷冻： 对装载液氮的容器采用部分真空便
可以造成液氮溅开，使液的沸点温度增高，从而使液氮气化的速率加快 。当液氮
从液态转变为气态时，吸收热量而使周围温度进一步下降，达到 – 208℃的低温。
这两种状态的液氮比普通液氮的温度更低，因此可以提供更快的冷冻速率和更好
的冷冻结果。他们已经 将这一技术成功的运用于牛、马和人的卵母细胞的玻璃化
冷冻。
(三)


水形成冰晶或玻璃化是有区别的(表13一1)。

与传统应用的 程序冷冻相比，玻璃化冷冻法除具有简便、迅速：经济等
优点外，并能避免胚胎冻融过程中细胞内外冰晶 的形成，因而目前备受重视(表
13–2)。