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找到黑龙蛋进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-09 12:04

膝盖软骨磨损-嗜睡多梦

2021年1月9日发(作者:金装雅培奶粉怎么样?金装雅培奶粉好吗?已解决)
《保健食品中育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非含量的测定方法液相
色谱- 质谱质谱法》编制说明
一、 任务来源

本标准是根据国家认监委下达的计划编号 为“2009B568”制标任务编写的。本标准由湖南出
入境检验检疫局承担研究和起草。

二、研究目的

育亨宾又称痿必治为非激素类药物,最早是从产于西非洲一种植物(Corynante Yohimb e)树
皮中提出的一种生物碱,现已有合成品。自古以来育亨宾即在非洲用作催欲药,1900年哥维及 苗
勒等应用于因神经衰弱所致的阳萎及麻痹性不感症取得疗效,因而用于临床。其药理作用能使血
管平滑肌扩张,降低交感神经张力,通过扩张阴茎的动脉,增加阴茎海绵窦血流量;使阴茎勃起,
并使 中枢性交感神经兴奋。适用于精神性、神经性、血管性及糖尿病性阳痿。是目前较为肯定而
且应用最多的 一种植物性治疗勃起功能障碍的药品,一般服用剂量为500mg。 但育亨宾并不适合
正在服用抗忧郁 剂的人仕服用﹐也不适合患有肾脏疾病或胃溃疡者服用。此外,服用高剂量的育
亨宾可能会导致严重的副 作用﹐包括丧失肌肉功能﹐血压升高,忧虑﹐心悸﹐眩晕等。对有些人
而言,育亨宾能引起幻觉。某些食 物如芝士﹐动物肝脏﹐红酒等﹐也应避免与育亨宾同时进食﹐
以免令血压升高。
西地那非俗称伟哥,磷酸二酯酶-5(inhibitor of phosphodiesterase type 5,简写PDE-5)
选择性抑制剂,原为一种抗心 绞痛的新药,由于其在临床试验中被发现有治疗男性勃起功能障碍
(Erectile dysfunction,ED)的作用而改变了研发方向,一般在用药后40 min 见效,剂量为50
mg。与其作用相似的药物还有德国Bayer与葛兰素史克公司联合开发的伐地那非,于2003 年8 月
获得FDA 批准在美国上市,此药用后10 min 起效,一般剂量为10 mg,对PDE-5的抑制能力是西
地那非的5倍,因而在临床上5、10、20 mg伐地那非的作用相当于25、50、100 mg 西地那非的作
用。美国Lilly公司开发的他 达拉非,商品名他达那非也获得欧盟批准上市,其对磷酸二酯酶5有
更好的选择性,促进阴茎勃起的效果 可长达36个小时。他达那非的平均起效时间是16 min。服用
量为10-20 mg,建议东方人服用量为25-35 mg。磷酸二酯酶5抑制剂的不良反应主要表现在中枢
神经、循 环和视觉系统,常见有头痛、面部潮红、焦虑、消化不良、腹部不适、肌痛、骨痛、血
尿;循环系统表现 为心律失常、心梗、心脏猝死、脑出血、高血压;视觉系统表现为对光敏感、
视力模糊、复视、眼肿、眼 压高、视物蓝绿。 磷酸二酯酶5抑制剂18岁以下的人禁用,对在6个
月内曾发生过心梗、中风、致死 性心律失常、低血压或高血压者、不稳定心绞痛者、冠状动脉病
和视网膜色素沉着患者慎用。对阴茎畸形 者慎用。急性冠状动脉综合征、冠心病明显缺血、心力
衰竭、急性心梗、中风、心律失常者忌用。对有出 血性疾病或胃溃疡、遗传性色素性视网膜炎、
脊髓损伤等中枢神经系统病、盆腔手术或创伤及接受放疗者 慎用。当服用较大剂量的西地那非时
会引起头痛、消化不良、头晕、皮疹等不良反应,更为严重的是,西 地那非能增强硝酸酯类药物
的降压能力,与任何一种短效或长效的硝酸酯类药物同时使用时,可能会引起 致命性低血压反应,
甚至导致突然死亡。
育亨宾、西地那非、伐地那非、他达那非等均为处方 药,因此在性保健品中被禁止使用,目
前不法保健品厂商为了使产品到达中药难以达到的快速效果,在一 些保健食品中加入这些违禁药
物,严重威胁了服用者的身体健康,影响出口保健品的信誉。卫生部和中国 食品药品管理局等部
门多次发文(如《卫生部、国家经贸委、工商总局、药品监督局关于开展保健食品专 项整治工作
的通知》(卫法监发[2002]172号)要求查处保健食品中添加此类药物的违法行为, 因此对保健
品中的壮阳违禁药物进行检测具有非常重要的意义。
育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非化学性质信息见表1。
三、国内外研究现状 目前,国外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法报道较少
[1-4]
,且多为单个或 两个同时
检测的方法,国外报道的较多,有液相色谱-紫外检测法、气相色谱-氢火焰检测法 、ESI-HPLC-MS
法及ESI-LCMSMS等
[5-15]
,但对育亨宾 的检测鲜有报道,更未见同时检测保健食品中这四种违禁
药物的报道,因而该方法具有创新性和现实意义 。国内外对西地那非、伐地那非、他达拉非检测
方法一览表见表2。
表 1 育亨宾、西地那非、伐地那非和他达拉非的基本化学信息
通用名 结构式 CAS 登陆号 分子式
分子

育亨宾:
yohimbin
146-48-5 C21H26N2O3 354.4

盐酸育亨宾 :
Yohimbine
Hydrochloride

65-19-0


390.91
西地那非:
Sildenafil

139755-83-2 C22H30N6O4S 474.6
枸橼酸西地那
非:Sildenafil
Citrate
171599-83-0 C22H30N6O4S·C6H8 O7 666.7

伐地那非:
Vardenafil
hydrochloride

224785-91-5

C
23
H
32
N
6
O
4
S
.
HCl

525.1
伐地那非盐酸
盐:
Vardenafil
hydrochloride
trihydrate
224785-90-4 C
23
H
32
N
6
O
4
S·HCl ·3H
2
O 579.1

他达那非;
tadalafil
171596-29-5

C< br>22
H
19
N
3
O
4
389.4


表2 西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表
目标化合物
西地那非
西地那非、伐地那

伐地那非
西地那非
样品名称 样品前处理方法

色谱柱
Discovery C18(5μm 250×4.6
mm I.D),流速:0.8 mLmin
Hypersi C18(5μm 250×4.6 mm
I.D),流速:0.5 mLmin
Spherigel C18(5μm 250×4.6
mm I.D),流速:1 mLmin
Zorbax Eclipse XDB-C18 柱(5
μm 150×2.0 mm I.D)
HP-5(15 m×0.25 mm I.D.,0.25
μm 膜厚。
Capcell Pak C18 柱 UG120, 5
μm 150×4.6 mm I.D.
C18 柱 UG120, 5μm 150×
4.6 mm I.D. ;流速1.0 mLmin。
Supelcosil LC-18 5μm 250×4
mm I.D.
C18 柱(5μm),流速1.0
mLmin
Phenomenex Luna C18 5μm 150
×4.6 mm I.D.
Chromolith Performance RP-18e
(100×4.6 mm I.D)
H 和C18 柱,10μm 300×3.9
mm I.D. (Waters,USA)
仪器方法
流动相
40 mmolL 磷酸三乙胺(pH=3.2)+甲醇
+乙腈=40+30+22
150 mL 乙腈与350mL 0.025 molL 三乙
胺(以磷酸调pH=3)
0.2%甲酸水溶液+乙腈=65+35

检测器
二极管阵列检测器,检测波长:
291 nm。
UV 检测器,292nm;
参考
文献
[1]
[2]
[3]
[4]
保健食品 甲醇超声提取5 min~30 min。
人血浆 液-液-液微萃取
保健食品 甲醇超声提取20min。
保健品 样品用甲醇超声提取
样品过Waters Sep-Pak Plus C18 固
相萃取小柱,用5 mL 10 mmolL 的
磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤后,
5mL 甲醇洗脱。
样品加入0.1 molL 碳酸钠缓冲液
后,用乙酸乙酯提取
样品中加入三氯醋酸和0.1 molL
NaOH 后,用乙酸乙酯提取。
甲醇提取
西地那非
人体血浆
和尿
人体血浆
和尿
精液
药品
西地那非
西地那非
伐地那非
西地那非、伐地那
非、他达那非
西地那非
他达那非
西地那非
西地那非
西地那非
MS 检测器:单极质谱检测器,
ESI+,mz 范围200-700
离子阱质谱检测器,在mz
乙腈和0.5%甲酸水溶液梯度洗脱,流速:
100-500 范围内全离子扫描并
0.25 mLmin
选择 mz 475 正离子方式。
MS 接口温度:300℃;EI 方式:
氦气,总流速50mlmin 。柱头压力
70 eV;EM 电压:1800V。SACN
110kPa ,流速1.0 mlmin , 进样口温
方式:扫描范围35 aum~550
度325℃,进样量2μL.,程序升温
aum,扫描速度:1.49scanss
乙腈+20 mmolL 磷酸钾缓冲液(pH4.5)
HPLC UV 检测器,292 nm
=3+7,流速1.0 mLmin。
乙腈+16 mmolL 磷酸(用NaOH 调pH
为5.3)=32+68,
乙腈+磷酸钠缓冲液(pH3)=2+8 ,流
速1.0 mLmin
20 mmolL 乙酸铵和0.2%甲酸水溶液梯
度洗脱。
二极管阵列检测器,检测波长:
230 nm。
UV 检测器,230 nm
UV 检测器,292nm;MS 检测
器:全扫描: mz 60-600,SIR 定

[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
口服液、
用甲醇稀释
酒、饮料
药品
药品
药品
体液
软饮料
药品用流动相超声提取20 min。
样品用甲醇超声(80℃)提取
样品用水湿润后用甲醇振药提取
乙腈+水=45+55(VV),流速1.0 mLmin。 UV 检测器,220 nm
0.1 molL 磷酸缓冲液(pH 3.0)+乙腈
=8+2; 流速0.5 mLmin
甲醇+水+乙腈=6+2+2,用0.1%冰醋酸调
pH 6.1,流速0.50 mLmin
乙腈+三乙胺和2 mmolL NH4COOH 缓
冲液梯度洗脱流速:0.20 mLmin
水+乙腈=13+7,用甲酸调pH 3.0,流速
1.0 mLmin
UV 检测器,230nm;
UV 检测器,290nm;
API-100 单四极杆质谱分析器,
阳离子方式,SIR ( mz
475,283,534)
MS 检测器:单极,正离子
样品加入NH4Cl 缓冲液(pH 9.5)
NovaPak C18(Waters,Milford,
后,用氯仿2丙醇
MA), 4μm 150×2.0 mm I.D.
n-heptane(251065)提取。
样品用甲醇稀释 TSK gel ODS 80TM(5μm 150
×4.6 mm I.D)
[14]
四、术语(《中国药典 2005 年版》)
片剂:系指药物与适宜的辅料压制而成的圆片 状或异形片状的固体制剂,抗疲劳保健食品
只要是口服普通片。
胶囊剂:系指药物或叫加有辅 料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。抗疲劳
保健食品胶囊剂主要为硬胶囊和软胶囊两类, 供口服用。
硬胶囊(通常称为胶囊):系采用适宜的制剂技术,将药物或加适宜辅料制成粉末、颗粒、
小片或小丸等充填于空心胶囊中的胶囊剂。
软胶囊:系将一定量的液体药物直接包封,或将固 体药物溶解或分散在适宜的敷形剂中制
备成溶液、混悬液、乳状液或半固体,密封于球形或椭圆形的软质 囊材中的胶囊剂。可用滴制
法或压制法制备。软质囊材是由胶囊用明胶、甘油或其他适宜的药用材料单独 或混合制成。
口服溶液剂(药酒与口服溶液剂一致):系制药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液 体
制剂。

五、方法论证
1、样品制备
本标准方法的样品制备按照《中国药典2005 年版附录I 制剂通则》的取样量及药典相关剂
型制备方法进行。对于片剂、胶囊剂进行检测时,最大的取样量均为20 片(粒),口服溶液剂
最大的取样量均为10 支。
片剂试样的制备方法:随机取同一批号的供试品20 片,研细(用研钵充分研成粉末状试样)。
硬胶囊试样的制备方法:随机取同一批号的供试品20 粒,倾出内容物,研细(用研钵充分
研成粉末状试样)。
软胶囊试样的制备方法:随机取同一批号的供试品20 粒,将内容物全部挤到一离心管中,
在混匀器上充分混匀,作为试样。
口服溶液剂试样的制备方法:随机取同一批号的供试品10 支(瓶),取等量体积样品到同
一容器中混匀作为试样。

2、试剂和材料
除另有说明外, 所用试剂均为分析纯,水为GBT 6682规定的一级水。
2.1 甲醇:液相色谱级。
2.2 乙腈:液相色谱级。
2.3 乙酸:优级纯。
2.4 0.1 %乙酸水溶液∶甲醇混合液:1+1(VV)。
2.5 育亨宾 (yohimbin)CAS 号:146-48-5,分子式:C21H26N2O3)标准品纯度大于等于99.0%。
2.6 他达那非(tadalafil,CAS号:171596-29-5,分子式:C22H19N3O4)标准品 纯度大于等
于99.0%。
2.7 西地那非(Sildenafil,CAS号:139 755-83-2,分子式:C22H30N6O4S)标准品:纯度大
于等于99.0%。
2.8 伐地那非(vardenafil,CAS号:224785-91-5,分子式:C23H 32N6O4S·HCl)标准品:
纯度大于等于99.0%。
2.9 标准溶液:分别准确称取适量育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准品,用甲
醇配制成浓度为10 μgmL的混合标准储备液(4℃下避光保存6个月)。根据需要用0.1 % 乙酸∶
甲醇混合液(4.4)将标准储备液稀释成1 ngmL、5 ngmL、10 ngmL、50 ngmL、100 ngmL
的混合标准工作溶液(4℃下避光保存1个月)。
3 仪器
3.1高效液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI)。
3.2 超声波清洗器。
3.3 旋涡混匀器。
3.4 分析天平:感量 0.1 mg和 0.01 g各一台。
3.5 真空泵。
3.6 离心机。
4 质谱条件的确定
将仪器条件、各路气体流量调到最佳值,使仪器响应达到最佳。API 4000优化的参数为: 雾< br>化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯液氮气,其参考值为:窗帘气(CUR):20.00;雾化气(GS1):40.00 psi;辅助加热气(GS2):45.00 psi;碰撞气(CAD):7.00 psi; 离
子源喷雾电压(IS):5000.00 V;TEM:550.00℃;ihe:ON。

采用Syringe Pump 对4 种目标化合物进行质谱条件的优化(以育亨宾为例)
4.1 Q1扫描寻找母离子,为355.2。
图 1 Q1扫描图

4.2 进行DP扫描,确定DP电压为108v。




图2 DP电压扫描图
4.3 Q3扫描确定子 离子为144.1和212.4;进行CE扫描和MRM试验,确定两个子离子的最佳CE值为30
和5 0,EXP值为15.
State Parameter Editor
Ion Source:Turbo Spray
Temperature Reached
Collision Gas (CAD):4
Curtain Gas (CUR):10
Ion Source Gas 1 (GS1):20
Ion Source Gas 2 (GS2):0
IonSpray Voltage (IS):4000.0
Temperature (TEM):0.0
Interface Heater (ihe):Off

Declustering Potential (DP):80.0
Entrance Potential (EP):10.0
Collision Energy (CE):41.0
Collision Cell Exit Potential (CXP):

Q1 Resolution:UnitQ3 Resolution:
Ion Energy 1 (IE1):1.6
Ion Energy 3 (IE3):4.2

Mass Spectrometer Method Properties

Period 1:
--------------
Scans in Period:20
Relative Start Time:0.00 msec
Experiments in Period:1

Period 1 Experiment 1:
----------------------------
Scan Type:Product Ion (MS2)
Polarity:Positive
Scan Mode:Profile
Ion Source:Turbo Spray
Product Of:355.30 amu
Resolution Q1:Unit
Resolution Q3:Unit
Intensity Thres.:0.00 cps
Settling Time:0.0000 msec
MR Pause:5.0070 msec
15.0
Unit
TIC of +MS2 (355.30): from Sample 1 (TuneSampleID) o...
3.2e6
3.0e6
Max. 3.2e6 cps. +MS2 (355.30): 19 MCA scans from Sample 1 (TuneSa...
3.5e6
144.1
Max. 3.5e6 cps.
I
n
t
e
n
s
i
t
y
,

c
p
s
I
n
t
e
n
s
i
t
y
,

c
p
s
2.5e6
2.0e6
1.5e6
1.0e6
5.0e5
0.0
0.23
3.0e6
2.5e6
2.0e6
1.5e6
1.0e6
5.0e 5
117.1
134.0
150
180.3
223.9
24 8.2
294.0
308.1
300350400
212.4
355 .2
100200250
mz, amu
0.10.20.30.4
Time, min
0.50.650

图3 子离子扫描图
同样方法确定各目标化合物的质谱条件见表3.
表3 4种目标化合物质谱条件
目标化合

育亨宾
伐地那非
西地那非
他达那非
Q1
mz
355.2*
355.2
489.5*
489.5
475.3*
475.3
390.4*
390.4
Q3
mz
144.1*
212.4
151.1*
312.1
100.1*
58.0
268.3*
135.1
DP电压
(V)
108
108
120
120
110
110
70
70
EP
(V)
10
10
10
10
10
10
10
10
CE
(V)
30
50
60
56
40
82
18
30
CXP
(V)
15
15
14
18
16
12
17
22
注:“*”为定量离子对。

5、色谱柱的确定
在上述质谱条件下,选择色谱柱COSMOSIL 5C18-MS-II Waters,2.1 × 150 mm, 5 μm;色谱
柱2:ZORBAX Eclipse XDB-C18,4.6 × 250 mm, 5 μm;流动相组成:0.1%乙酸水溶液与乙
腈梯度洗脱。 此两种色谱柱均能对该4种化合物进行分离,从实验室通用性考虑,我们采用
了ZORBAX Eclipse XDB-C18,4.6 × 150 mm, 5 μm。

6
流动相组成的确定
由于有机相的含量对目标化合物洗脱影响较大,采用等梯度洗脱时,若有 机相含量低,伐
他达那非难以洗脱,提高有机相含量,不仅伐地那非、西地那非分离不佳,而且育亨宾洗 脱速
度太快,易产生离子抑制效应,影响定量分析,因而我们采取了梯度洗脱方式。通过实验证明,在流动相中加入0.1%的乙酸,可以减少拖尾,优化色谱峰型。经过实验证明,流速为500 μ
Lmin, 在下列梯度洗脱条件(见表4)下,4种目标化合物均得到了很好的分离(见图4)。
表4 流动相梯度洗脱程序
时间
min
0.1%乙酸水溶液
%
乙腈
%
0.00
3.00
8.00
13.00
13.01
20.00
80.0
80.0
5.0
5.0
80.0
80.0
20.0
20.0
95.0
95.0
20.0
20.0



图 4 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准提取离子叠加色谱图及提取离子色谱图
5、标准曲线和线性范围
在所选择的LCMSMS 条件下,采用选择的定量离子,4种目标 化合物在1ngmL-100ngmL
范围内成线性关系,线性方程、相关系数和线性曲线见图5-8。

Untitled 5 (yhb):
4.0e6
3.8e6
3 .6e6
3.4e6
3.2e6
3.0e6
2.8e6
2.6e6< br>A
r
e
a
,

c
o
u
n< br>t
s
2.4e6
2.2e6
2.0e6
1.8e6
1 .6e6
1.4e6
1.2e6
1.0e6
8.0e5
6.0e5< br>4.0e5
2.0e5
0.0
510455055
Concentra tion, ngmL
6095100

图 5 育亨宾定量离子对(355.2144.1)线性曲线(r=0.9997)
Untitled 5 (fsnf):
6.0e5
5.5e5
5.0e5
4.5e5
4. 0e5
A
r
e
a
,

c
o
un
t
s
3.5e5
3.0e5
2.5e5
2.0e5< br>1.5e5
1.0e5
5.0e4
510455055
Concent ration, ngmL
6095100

图6 伐地那非定量离子对(486.5151.1)线性曲线(r=0.9993)
Untitled 5 (xdnf):
8.4e5
8.0e5
7.5e5
7.0e5
6. 5e5
6.0e5
A
r
e
a
,

c
o
u
n
t
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5.5e5
5.0e5
4.5e5< br>4.0e5
3.5e5
3.0e5
2.5e5
2.0e5
51 0455055
Concentration, ngmL
6095100

图 7 西地那非定量离子对(475.3100.1)线性曲线r=0.9997
Untitled 5 (xls):
7.0e5
6.5e5
6.0e5< br>5.5e5
5.0e5
4.5e5
4.0e5
3.5e5
3. 0e5
2.5e5
2.0e5
1.5e5
1.0e5
5.0e40.0
510455055
Concentration, ngmL
6095100
A
r
e
a
,

c
o
u
n
t
s

图 8 他达那非定量离子对(390.4268.3)线性曲线r=0.9996
超出线性范围后,应当对提 取液进行适当的稀释,使得检测的响应在线性范围之内。根据样
品处理方法,在此浓度范围内,它们分别 相当于样品含有目标化合物:固体样品为1.0 mgkg~
100.0 mgkg的含量范围,液体样品为0.010 mgL~100.0 mgL.此时固体样品的检测定量低限为
1.0 mgkg,液体样品的定量低限为 0.01 mgL,满足保健食品中是否添加有这4种违禁药物检验
要求。


XIC of +MRM (8 pairs): 355.2144.1 amu from Sample 17 (std1) of (Turbo Spray)
7730
7500
70006500
6000
5500
5000
9.25
Max. 7730.0 cps.
I
n
t
e
n
s
t
y
,

c
p
s
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
2.72
0
11
Time, min
7
18.48
18192021
9.54

图 9 育亨宾检测低限1 ngmL 提取离子色谱图


图 10 伐地那非检测低限1 ngmL 提取离子色谱图

图 11 西地那非检测低限1 ngmL 提取离子色谱图

图 12 他达那非检测低限1 ngmL 提取离子色谱图
6、实验室内精密度实验
6.1 量取待测试样1.0 mL 于10.0 mL 容量瓶中,加入0.1 %乙酸l+甲醇(1+1,VV)
经充分混匀后定容,过0.45 μm 微孔滤膜后,上LCMSMS 测定。实验试样:氨
基酸饮品,该试样不含待测违禁物。
表 5 氨基酸饮品育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非
添加实验室内精密度实验结果
育亨宾
添加
水平
(ng
mL)
测定
结果
(ng
mL)
回收测定结
率 果
变异
(%) (ngm
系数
L)
CV
(%)



93.6
-112
伐地那非
西地那非 他达那非
变异
回收
系数

CV
(%)
(%)
10.0
10.4


9.80

11.2
5.8
9.36
10.7
变回收率
异(%)
测定结



(ngm
CV
L)
(%

9.95
9.77

9.11
8.91

9.15
5.7
81.1-
9.42
97.9
9.09 10.7
8.11
9.48


49.6

43.3
4.6
47.6
48.2
44.7
45.9
95.8

93.9

98.6
4.3
94.3



85.6-



86.6-
99.2
9.7
10.2
45.6
51.6
49.3
50.1
48.6
45.3
51.5
99.1
变异测定结
回收
系数果

CV(ngmL
(%)
(%) )



5.3



91.1
-107
9.77
8.58
9.27
5.5
9.03
8.85
8.21
82.1-
97.7
10.2
50.0 51.9

50.4

48.3
2.4 96.6
-104
51.5
49.6



4.8



91.2
-103
48.2
50.6
48.3
47.6
50.2
44.9
96.5
98.9
90.9
102.7
4.2
92.8-
103


89.8-
3.9
101
50.3
100 97.5

102.8


92.2
4.4 94.4
94.4


95.8

101.4
3.0 95.8
105.3
104.1
95.6

-104
85.6
91.7
98.6

102.7
98.7
-105
93.7
92.8

图 13试剂空白提取离子叠加色谱图

图 14 氨基酸口服液提取离子叠加色谱



图 15 氨基酸口服液添加10 μgL 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
XIC of +MRM (8 pairs): 390.4268.3 amu from Sample 26 (2tian5) of (Turbo Spray)
3.6e4
3.4e4
3.2e4
3.0e4< br>2.8e4
2.6e4
2.4e4
Max. 5575.0 cps.
I
n
t
e
n
s
t
y
,

c
p
s
2.2e4
2.0e4
1.8e4
1.6e4
1.4e4
1.2e4
1.0e4
8000.0
6000.0
40 00.0
2000.0
0.0
11
Time, min
718192021
11.78


图 16氨基酸口服液添加50 μgL 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
XIC of +MRM (8 pairs): 390.4268.3 amu from Sample 27 (2tian10) of (Turbo Spray)
7.2e4
7.0e4
6.5e4
6.0e4
5.5e4
5.0e4
4.5e4
4.0e4
3.5e4
3.0e4
2.5e4
2.0e4
1 .5e4
11.79
1.0e4
5000.0
0.0
Max. 1.1e4 cps.
I
n
t
e
n
s
t
y
,

c
p
s
11
Time, min
718192021


图 17 氨基酸口服液添加100 μgL 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
6.2、片剂样品提取方法的选择及实验室内回收率
称取碾碎混匀的样品1.00 g于100 mL 容量瓶中,加入80 mL甲醇于超声波清洗器中超声处理
30 min 后,取出冷却,用甲醇定容并充分混匀,定量取1.0 mL 提取液于10.0 mL 容量瓶中,用
0.1%乙酸+甲醇(1+1)定容后混匀,过0.45μm 微孔滤膜后,上LCMSMS 测定。我们选择了可邦
男性抗衰老片作为添加回收实验样,经试验该试样 中不含这4种违禁药物。



表 6 可邦 男性抗衰老片中添加育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非实验室内精密度数据及回收率

育亨宾

伐地拉非
西地拉非
变异 回收率
测定结果
系数 (%)
(mgkg)
CV
变异
系数
CV
测定结

mgkg
他达那非
回收率
(%)
变异
系数
CV

测定结变异 测定结回收率
回收率
果 系数 果 (%)
(%)
mgkg CV mgkg
样品
未检出
0.95


0.87

0.88

1.01
1.0
1.09
0.89
0.81
0.98






81.0
-109






8.9
未检出
0.93
1.07
0.87
0.82
1.05
0.92
0.96
1.04






82.0
-107






8.8
未检出
1.02
0.85
0.97
1.06
0.94
0.83
0.98
0.80






80.0
-106






9.2

未检出
1.06
0.83
0.81
0.96
0.87
0.94
0.82
0.97






81.0
-106

9.1




2.0
1.65
1.89
1.74
1.86
1.67
1.75
1.77
1.60
3.53
3.61
3.89
3.59
3.65
3.89
3.66
3.92





80.0
-94.5





5.4
1.72
1.65
1.89
1.69
1.87
1.61
1.78
1.72
3.40
3.61
3.87
3.58
3.66
3.94
3.61
3.80





80.5
-95.5






4.9
1.87
1.96
2.05
1.81
2.03
1.93
2.04
1.83
3.77
4.02
3.56
3.87
3.71
3.55
3.78
3.81





90.5
102-






4.8
1.75
1.94
1.79
1.70
1.95
1.82
1.90
1.83
3.29
3.42
3.53
3.81
3.56
3.91
3.49
3.52





85.0
-97.0
4.5





4.0





88.3
-97.3





3.9





85.0
-98.5





4. 2





88.8
-101





3.9





82.3
-97.8
5.3


图 18 可邦男性抗衰老片提取离子叠加色谱图


图19 可邦男性抗衰老片添加1 mgkg育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图

XIC of +MRM (8 pairs): 390.4268.3 amu from Sample 29 (27tian5) of (Turbo Spray)Max. 6.1e4 cps.

2.6e5
2.5e5
2.4e5
2.3e5
2.2e5
2.1e 5
2.0e5
1.9e5
1.8e5
1.7e5
I
n
t
e
n
s
t
y
,

c
p
s
1.6e5
1.5e5
1.4e5
1.3e5
1.2e5
1.1e5
1.0e5
9.0e4
8.0e4
7.0e4
6.0e 4
5.0e4
4.0e4
3.0e4
2.0e4
1.0e4
0.0
11
Time, min
718192021
11.77
图20 可邦男性抗衰老片添加5 mgkg育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图



XIC of +MRM (8 pairs): 390.4268.3 amu from Sample 30 (27tian10) of (Turbo Spray)Max. 1.3e5 c ps.
5.2e5
5.0e5
4.8e5
4.6e5
4.4e54.2e5
4.0e5
3.8e5
3.6e5
I
n
t< br>e
n
s
t
y
,

c
p
s< br>3.4e5
3.2e5
3.0e5
2.8e5
2.6e5
2. 4e5
2.2e5
2.0e5
1.8e5
1.6e5
1.4e51.2e5
1.0e5
8.0e4
6.0e4
4.0e4
2.0 e4
0.0
11
Time, min
718192021
11.76
图21 可邦男性抗衰老片添加10 mgkg育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图











6.3 营养胶囊室内回收率实验数据


表 7 营养胶囊育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非
添加实验室内精密度实验结果

育亨宾

伐地拉非
西地拉非
变异 回收率
测定结果
系数 (%)
(mgkg)
CV
变异
系数
CV
测定结

mgkg
他达那非
回收率
(%)
变异
系数
CV

测定结变异 测定结回收率
回收率
果 系数 果 (%)
(%)
mgkg CV mgkg
样品
未检出
0.85


0.87

0.98

1.01
1.0
0.81
0.89
0.91
0.78






78.0
-101






8.3
未检出
0.83
1.03
0.88
0.92
1.08
0.82
0.93
0.98






82.0
-108






9.3
未检出
0.94
0.79
0.90
0.83
1.08
0.87
0.86
0.91






79.0
-108






9.4

未检出
1.06
0.93
0.89
0.86
0.84
0.95
0.91
0.80






81.0
-106

8.2




2.0
1.55
1.81
1.84
1.96
1.87
1.65
1.77
1.69
3.23
3.91
3.39
3.29
3.75
3.49
3.36
3.97





77.5
-98.0





7.0
1.82
1.61
1.87
1.89
1.67
1.69
1.88
1.70
3.20
3.69
3.37
3.48
3.26
3.90
3.41
3.95





80.5
-94.5






5.9
1.67
1.86
1.95
1.61
1.97
1.80
1.88
2.06
3.37
4.07
3.86
3.33
3.51
3.75
3.48
3.91





80.5
103






7.7
1.65
1.74
1.89
1.90
1.75
1.62
1.99
1.73
3.79
3.22
3.44
3.71
3.96
4.11
3.28
3.86





81.0
-99.5
6.8





4.0





80.7
-99.3





7.6





80.0
-98.7





7.5





83.3
-102





7.0





80.5
-103
8.3



7、实验室间精密度数据
按照GBT 6379.2-2004 实验室间协同实验的要求,本方法在厦门局、深圳局等5 个实验
室进行了协 同实验,采用不含有育亨宾、伐地那非、西地那非和他达那非的实际样品分别作3个
水平的添加实验,结 果见表7、表8。

表 7 片剂样品实验室间精密度数据

添加浓度

1 mgkg
厦门检验检疫局
0.900
1.74
10.12
0.948
1.84
9.89
0.815
1.77
9.70
0.866
1.85
9.91
0.905
1.88
9.96
0.945
1.78
9.76
0.831
1.73
9.81
0860
1.77
9.96
深圳检验检疫局
0.953
2.29
10.55
0.911
2.06
10.65
0.826
1.99
10.49
0.989
2.03
10.52
0.977
2.21
10.52
0.967
2.11
10.72
0.809
2.03
10.51
0.971
2.23
10.75
云南境检验检疫局
0.982
1.95
9.41
0.982
1.81
8.45
0.975
1.85
8.71
0.967
1.70
10.51
0.994
1.97
9.24
0.894
1.77
8.66
0.963
1.79
9.17
0.936
1.78
10.56
福建检验检疫局
0.821
1.78
9.15
0.841
1.88
9.05
0.909
1.95
8.28
1.02
1.71
10.76
0.827
1.82
9.18
0.827
1.98
9.08
0.900
1.86
8.47
1.04
1.84
10.81
湖南师范大学
0.852
1.89
8.85
0.892
1.72
8.55
0.806
1.75
10.02
0.907
1.89
8.75
0.867
1.85
8.88
0.906
1.71
8.68
0.811
1.63
9.81
1.08
1.81
9.01
平均值
mgkg
0.908
1.94
9.58
0.911
1.87
9.35
0.865
1.84
9.50
0.963
1.86
10.15
回收率 %
82.1-99.4
89.0-105
88.5-106
82.7-98.2
85.5-106
84.5-107
80.6-97.5
81.5-101
82.8-105
87.0-108
85.5-111
90.5-108
CV %
6.8
8.8
6.5
5.3
7.1
8.7
7.2
6.5
7.3
7.1
8.2
6.9
育亨

2 mgkg
10 mgkg
1 mgkg
伐 地
那 非
2 mgkg
10 mgkg
1 mgkg
西 地
那 非
2 mgkg
10 mgkg
1 mgkg
他 达
那 非
2 mgkg
10 mgkg
注:样品经检测不含待测组分。







表 8 口服液样品实验室间精密度数据
添加浓度
10 μgL
育亨

20 μgL
厦门检验检疫局
8.85
20.7
9.07
20.1
109.5
9.73
21.0
109.3
9.72
21.1
104.2
9.79
19.3
108.3
深圳检验检疫局
9. 97
18.6
97.6
8.77
21.3
80.2
9.01
18.1
83.5
10.2
17.2
77.7
9.93
17.8
105.4
8.35
18.6
79.3
8.52
17.6
78.8
10.8
16.9
80.2
福建检验检疫局
8.84
21.9
91.0
8.46
18.9
88.2
8.91
19.1
93.1
8.69
21.0
109.4
9.02
19.8
83.7
8.20
19.1
82.4
8.19
20.1
82.5
8.36
19.8
90.7
云南检验检疫局
8.15
20.5
93.6
9.17
17.1
86.6
8.72
17.2
97.6
10.2
17.6
82.4
8.58
19.9
89.5
9.22
16.6
80.7
8.70
19.9
98.3
11.1
18.8
83.1
湖南师范大学
9.62
20.9
79.8
9.79
20.5
107.1
9.87
20.1
105.4
9.87
20.1
105.2
9.92
19.1
86.7
9.34
19.2
98.2
9.10
19.5
97.4
9.20
19.7
97.7
平均值
mgkg
9.19
19.9
93.0
8.99
19.2
90.3
8.98
19.1
93.1
9.80
18.9
92.9
回收率 % CV %
81.5-99.7
89.0-109
79.8-109
83.5-97.9
83.0-105
79.3-109
87.0-98.7
88.0-106
78.8-105
83.6-111
89-105
77.7-109
6.5
5.7
9.4
5.8
7.6
11.6
5.4
6.2
9.3
8.3
6.7
12.4
100 μgL 93.1
10 μgL
伐 地
20 μgL
那 非
8.91
19.7
100 μgL 91.2
10 μgL
西 地
20 μgL
那 非
9.12
18.6
100 μgL 90.2
10 μgL
他 达
20 μgL
那 非
9.81
18.9
100 μgL 95.6

以上实验数据表明,本方法 实验室内、实验室间的各项技术指标满足国标要求。方法简便易操作,实用性强。可以满足保健
食品中是否加有育亨宾、伐地那非、西地那非和他达那非的准确定性定量分析。

8、采用本标准对市场样品抽查结果

序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
样品名称
东方超能
海狗丸
生命A蛋白
真动力
王中华
起点
肾源动力因子
印度战神
藏秘肾宝
威博士
济仁强肾
无敌天下
黄金肾源
朗贝
炮炮红
精气神
一粒火爆
汉宫乐王
可邦
二十六味帝皇丸
美国金邦德
藏方天杵
西洋参
曹开镰
龟鹿海狗
氨基酸口服液
育鸿宾
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
757mgkg
ND
他达那非
ND
ND
6.24 mgg
7.82 mgg
7.49 mgg
8.51 mgg
ND
ND
ND
7.76 mgg
ND
ND
ND
26.1mgg
ND
ND
ND
40.7 mgkg
ND
ND
58.5 mgkg
52.3 mgkg
ND
13.4 mgkg
ND
ND
西地那非
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
673 mgg
570 mgg
ND
ND
11 mgg
450 mgg
641 mgg
542 mgg
780 mgg
166mgkg
ND
ND
0.84 mgkg
ND
ND
ND
ND
ND
ND
伐地那非
ND
ND
ND
ND
ND
ND
7 mgkg
ND
ND
ND
16.8 mgg
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND

从市场抽样看,26个样本中只有5个样本没有加育亨宾等4种药物,仅占19.2%。
伐地那非使用最多,占38.5%;西地那非次之,占34.6%;他达那非占7.7%;育亨宾
占3.8%。而育亨宾作为一种新型壮阳药物,国内还未建立过检测方法,也未见过对
这种药物使用情况的调查,这次我们意外发现“龟鹿海狗”保健品中含有该成
分,说明市场已开始使用。



参考文献
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