吃减肥药好吗抗体实验方法

2021年1月7日发(作者：宝宝益生菌要吃多久)
抗体实验方法

一、抗血清的制备

有了质量好的抗原，还必 须选择适当的免疫途径，才能产生质量
好（特异性强和效价高）的抗体。

（一）用于免疫的动物

作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、
豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择
主要根据抗原的生物学特性 和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r
-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且 能够
提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，
最好为雄性，此外还 需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体
差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西 兰兔，
一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。

（二）免疫途径

免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、
淋巴结内注射等，一般常 用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1
ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性 ，如激素、
酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。

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（三）佐剂

由于不同个体对同一抗原的反应性不同， 而且不同抗原产生免疫
反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗
原的 抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免
疫佐剂。

佐剂除 了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更
主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫 反应的免疫活性细胞
增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞
免疫和 抗体的产生。

常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常 是羊毛
脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：
2～9（VV），这 是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～2
0mg卡介苗就成为完全佐剂。

配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混
匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫 前取等容积完全或不完全佐
剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要
量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加
卡介苗3～4mgml或不加），加 完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上
5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射 器装
抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来
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回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注
射器作注射用。

（四）免疫方法

抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂 量约为首次
剂量为14左右。每2～3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐
剂，首次免疫时 皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百
日咳疫苗。

在第2次加 强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，
检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需 再进行加强免疫，直
到满意时为止（图2-3）。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制
备抗 血清。


图2-3 抗体反应

（五）抗血清的采集与保存

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家兔是最常用以产生抗 体的动物，因此这里主要讨论兔血的收
集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有 关
资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉
入血，也可心脏采血。取 动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木
匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去 耳缘的
毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉
耳尖，以单面剃须 刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即
流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球压迫 止血，凝血后洗去二
甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放
血时， 将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动
脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌 要求进行。

收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切
勿冰 冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，
分装（0.05～0.2 ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4。C
冰箱保存。

（六）抗血清质量的评价

在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间
内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地
采血测试。只有在对抗血清 的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的
评价后，才可使用所取得的抗血清。

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1．效价 抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。
效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某
些由大分子（如蛋白类）抗原所产生 的抗体，可用双扩散等方法测定。
前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。

（1）放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，
孵育24h后，测定其结合率。通常 以结合率为50%的血清稀度和为效
价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则 该血清的
效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，
还受标记抗 原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素
的影响，在工作中必须引起注意。（测定方法见 第8章 ）

（2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，
两者 在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓
度。

球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂
内，于水浴中加温，搅拌， 使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶
液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液 中的浓度
为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其
冷却，完全凝 固后，用打孔器打孔（图2-4）。中央孔内加适量抗原
（容量为50μl），周围各孔内分别加入50 μl 1：2、1：4、1：8、
1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有 无沉淀线
产生，以判断血清的稀释度（图2-5）。

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图2-4 双向扩散模型


图2-5 免疫扩散试验

2．特异性测定 抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相
应的抗原及近似的抗原物 质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别
能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率 低，表
示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑
制曲线来判断的。以 不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制
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曲线，计算各自的 结合率（BT或BB0），求出各自在IC50时的浓
度，按下列公式计算交叉反应率。

S=yZ×100%

S：交叉反应率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质
的浓度。

如某抗原的IC50浓度为90Pg管，而一些近似抗原物质IC50浓
度几乎是无限大，可以说这一抗 血清与其它抗原物质的交叉反应率近
似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。

3．亲合力 在免疫学中， 亲合力是指抗体与结合抗原体的
活度或牢固度。抗体与抗 原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合
力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小， 抗体分
子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。
亲合力常以亲合常数 K表示。K的单位是升摩尔（Lmol）。在RIA
中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的 倒数，K=1[H]，
[H]是最小检出量，通常，K的范围在108～1012Lmol之间，也有高
达1014Lmol的。

计算亲合常数的方法20余种，计算出的K都不能真实反映实验
情况，只能作为参考。

（七）免疫失败的可能原因及应采取的措施

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有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。


（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属
或品系，或扩大免疫动物的数量。

（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂
家的其它批号， 也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。


（3）制备的免疫原是 否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或
载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，
或加强乳化。

（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的
途径是否合适。

（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生
（通风、采光、 温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。


二、单克隆抗体的制备

1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细 胞与和绵羊红
细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，
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又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突
破使 血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。

免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异 性强、亲合力大、滴
度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动
物将产 生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一
个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而 形成的杂交廇细胞经无
性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质
地纯 一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也
一致。单克隆抗体（McAb）的特性和 常规血清抗体的特性比较见2-3。

表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较

项目

抗体产生细胞

常规免疫血清抗体

多克隆性

McAb

单克隆性

特异性识别多种抗原特异性识别单一抗原决定
抗体的结合力

决定簇

免疫球蛋白类别
不均一性，质地混杂

及亚类

特异性与亲合力

批与批之间不同

特异性高，抗体均一

同一类属，质地纯一

簇

0.01～0.1mgml（小鼠0.5～5.0mgml(小鼠腹
有效抗体含量

腹水）

水)

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0.5～10.0μgml（培
养物上清液）

用于常规免疫学
可用

实验

抗原抗体形成格
子结构（沉淀反容易形成

应）

抗体混杂，形成2分子
抗原抗体反应

反应困难，不可逆

单克隆抗体的制备方法如下。

（一）动物的选择与免疫

1．动物的选择 纯种BALBC小鼠，较温顺，离窝的活动 范围
小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的 实验室多选用纯种BALAC小鼠。

2．免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融 合杂交的成
功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确
立免疫方案开 始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一 般要加佐剂，半抗原应先制
备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

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单抗组合应用

一般难形成

可形成2分子反应，可逆

初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点 注射或脾内
注射（一般0.8～1ml,0.2ml点）

↓3周后

第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注
射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断< br>有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原
的免疫原性，另一方面可降低 抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，
基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高 机体
的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

（2）颗粒抗原免疫性强 ，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

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初次免疫 1×1070.5ml ip

↓2～3周后

第二次免疫 1×1070.5ml ip

↓3周后

加强免疫（融合前三天）1×1070.5ml ip或iv

↓

取脾融合

（二）细胞融合

1．细胞融合前准备

（1）骨髓瘤细胞系的选择 ：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一
品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内
产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

耐 受
Ig链

名 称

来 源

药 物

P3X63-Ag8(X63)

H L

BALBC骨髓瘤8-氮鸟r1 K

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MOPC-21

嘌呤

8-氮鸟
P3X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)

P3X63-Ag8

嘌呤

－ －

8-氮鸟－ K（不分
P3NSI-1-Ag4-1(NS-1)

P3X63-Ag8

嘌呤

（X63×BALBC8-氮鸟
(P3Ul)

脾细胞）杂交瘤

嘌呤

（X63×BALBC8-氮鸟
SP20-Ag14(SP20)

脾细胞）杂交瘤

嘌呤

8-氮鸟
F0

BALBC骨髓瘤

嘌呤

5-溴脱
.1

P3X63-Ag8

氧尿嘧－ －

啶核苷

BALBC骨髓瘤6-巯鸟
MPC11-45.6TG1.7

MPC-11

嘌呤

r2b K

－ －

－ －

－ －

泌型）

LOU大鼠骨髓8-氮鸟
1.2.3

瘤R210

嘌呤

－ K

人骨髓瘤6-巯鸟
GM15006TG-A12

GM1500

嘌呤

r1 K

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人骨髓瘤8-氮鸟
U-266AR

U-266

嘌呤

ε λ

骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RP MI1640，DMEM培养
基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×10 5ml
为宜，最大浓度不得超过106ml。当细胞处于对数生长的中期时，
可按1：3～1： 10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过
程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮 鸟嘌呤进行处理，
使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

（2）饲养细胞：在 组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生
长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所 加入的
这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节 需
要加饲养细胞，如 在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加
入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹 腔巨噬细胞（较
为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3
T3经放射 线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或
105细胞孔。

2．细胞融合的步骤

（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALBC小鼠，6～10周

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↓

拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）
↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

冲洗液放入10ml离心管，1200rpm分离5～6min

↓

用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整
细胞数至1×105ml

↓

加入96孔板，100μl孔

↓

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放入37。c CO2孵箱培养

（2）制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

↓

无菌取脾脏，培养液洗 一次

↓

脾脏研碎，过不锈钢筛网

↓

离心，细胞用培养液洗2次

↓

计数

↓

取108脾淋巴细胞悬液备用

（3）制备骨髓瘤细胞

取对数生长骨髓瘤细胞离心

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↓

用无血清培养液洗2次

↓

计数，取得×107细胞备用

（4）融合

①将骨髓瘤细胞与脾细 胞按1：10或1：5的比例混合在一起，
在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1 200rpm,8m
in;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。
轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边
加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分
别加入1ml、2ml、3ml、 4ml、5ml和6ml。

④离心，800rpm, 6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细 胞层的96孔板内，每孔加100
μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

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⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测

1．HAT选择杂交瘤细胞 脾细 胞和骨髓瘤细胞经PEG处理
后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细
胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷
激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移 酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞
具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后
瘤细胞消失，杂交细胞 形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后
应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在 上述选择培养
期间，杂交瘤细胞布满孔底110面积时，即可开始检测特异性抗体，
筛选出所需 要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换
一半培养液。

2．抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的
类型不同，选择不同的筛选方法，一般 以快速、简便、特异、敏感的
方法为原则。

常用的方法有：（1）放射免疫测定 （RIA）可用于可溶性抗原、
细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可 溶性
抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表
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面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、
旋转粘附双层吸附试验等。

（四）杂交瘤的克隆化

杂交瘤克隆化 一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT
筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆 。在实际工作
中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非
分泌细胞、所 需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的
分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化 。克隆化的原则是，
对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞
会被抗 体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗
体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果 会使抗体分泌的细胞丢
失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤
细胞 的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

1．有限稀释法克隆

（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

（3）调整细胞为3～10个细胞ml。

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（4） 取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细
胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱 中 。

（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

（8）每个克隆应尽快冻存。

2．软琼脂培养法克隆

（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的R
PMI1640。

①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

②0.5%琼脂：由1份1% 琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的
RPMI1640配制而成。置42℃保温。

（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9
cm的平皿中，在 室温中待凝固后作为基底层备用。

（3）按100ml，500ml或5000ml等浓度配制需克隆的细胞悬
液。

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（4）1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓
度的细胞悬液相混合。

（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝
固，孵育于37℃、5%CO2孵箱 中。

（6）4～5天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移
种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。

（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏

1．杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细 胞每次克
隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌
抗体的细胞系的时 候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、
分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存， 则可因上述意
外而前功尽弃。

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一 样，原则上细
胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培
养环境不同 而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就
可以装一支安瓿冻存。

细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲
基亚砜）。

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冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立 即降
至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存
装置进行冻存。冻存 细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的
稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

2．细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水
浴中，在1min内使冻 存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，
然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37 ℃、5%CO2孵
箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

（六）单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获
取单克隆抗体。但此方法产 量低，一般培养液内抗体含量为10～60
μgml,如果大量生产，费用较高。

（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按 1～3×107ml接种于
小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后< br>（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达
到1～10mgml。但采血量有限。

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②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或
液体石蜡 于BALBC鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，
接种细胞7～10天后可产生腹水，密 切观察动物的健康状况与腹水征
象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提
腹水，可反复收集数次。腹 水中单克隆抗体含量可达到5～10mgml，
这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复 苏后转种小
鼠腹腔则产生腹水块、量多。

（七）单克隆抗体的鉴定

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方
面的鉴定：

1．抗体特异性的鉴定 除用免疫原（抗原）进行抗体的检测
外，还应该用与其抗原成 分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用
ELISA、IFA法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的Mc Ab，除用黑色素
瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反
应，以便 挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重
组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否 与表达菌株的蛋白有交
叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

2．McAb的Ig类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记
的第二抗体进行筛选时已经基本上确 定了抗体的Ig类型。如果用的
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是酶标或荧光素标记的兔抗鼠I gG或IgM，则检测出来的抗体一般是
IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作 双扩或夹
心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有
利于沉淀 线的形成。

3．McAb中和活性的鉴定 用动物或细胞的保护实验来确
定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则
可用抗体和病毒同时接种于易 感的动物或敏感的细胞，来观察动物或
细胞是否得到抗体的保护。

4．McAb识别抗原表位的鉴定 用竞争结合试验，测相加指数
的方法，测定McAb所识别抗原位 点，来确定McAb的识别的表位是否
相同。

5．McAb亲合力的鉴定 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定M
cAb与相应抗原结合的亲合力。



（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收
获，努力就一定可以获得 应有的回报）


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