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上环时间维生素K的测定

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-06 08:14

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2021年1月6日发(作者:新生儿吐泡沫怎么回事)
维生素K的测定


此处介绍蔬菜中维生素K1的测定方法(HPLC法) 和食物及饲料中水溶性维生素K3(甲
萘醌)的测定方法
一、蔬菜中维生素K1的测定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的维生素K1 经有机溶剂提取后,经失活的磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱进行净化,
再用液相色谱法将维生素K1分离 并进行定性定量测定。
2.适用范围
本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素K1的测定。
3. 仪器:
(1) 实验室常用设备
(2) 打碎机
(3) 202-R型恒温干燥箱
(4) 色谱柱:为0.8cm×30cm的玻璃柱,底端收缩变细,并装有活塞,活塞上约1 cm处 有
一玻璃筛板,筛板孔径为16~30μm,柱上端膨大为容积约30ml的储液池。使用前需干燥
(5) 旋转蒸发器
与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶:具塞,圆底,容积为150ml。
(6) 恒温水浴锅
(7) 高纯氮气
(8) 高速离心机
与高速离心机配套的小离心管:具塞,容积为1.5~3.0ml。
(9) 紫外分光光度计
(10) HPLC:高效液相色谱仪,带紫外检测器
4.试剂
除特殊说明实验用水为蒸馏水,试剂为分析纯,有机溶剂使用前需重新蒸馏。
3.1 无水硫酸钠:使用前需在150℃的烘箱内烘烤4~8小时,以去除水分。
3.2 0.14molL Na2SO4溶液:称取20g无水硫酸钠,用蒸馏水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮:分析纯。
3.4 石油醚:沸程30~60℃,分析纯。
3.5 0.6molL碘化钾溶液:称取10g碘化钾,用蒸馏水溶解定容至100ml。
3.6 5gL淀粉液:称取0.5g可溶性淀粉,用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚:分析纯。不含过氧化物。
(1) 过氧化物的检查方法:用5ml乙醚加1ml0.6mol L碘化钾溶液,振摇1min,如有过氧
化物则放出游离碘,水层呈黄色。或加4滴5gL淀粉液,水层 呈蓝色。则该乙醚含有过氧
化物需处理后使用。
(2) 去除过氧化物的方法:重蒸时瓶中加一段纯铁丝,弃去10%初馏液和10%残留液。
3.8 洗脱液:石油醚+乙醚(97+3)。
3.9 甲醇:优级纯。
3.10 正己烷:优级纯。
3.11 磷酸氢二钠:分析纯。
3.12 中性氧化铝:100~200目。
3.13 氧化铝的处理:
(1) 磷酸盐处理氧化 铝:取250g中性氧化铝,20g磷酸氢二钠,1.6L蒸馏水,放入容积
为2L的锥形瓶中沸水浴3 0min,不时摇动或搅拌。冷却,倒掉上层液体(包括悬浮的细小
颗粒),然后用布氏漏斗抽滤。将残 留物转至平底玻璃皿中,于150℃干燥箱中烘烤3~5h
至两次称量相差3g以下,烘烤过程中不时搅 拌,以避免结块,冷却后放入干燥器中保存。
(2) 失活处理氧化铝:使用前,将磷酸盐处理的氧 化铝,加入具塞锥形瓶中。每100g氧
化铝加9.0ml去离子水,盖紧瓶塞,蒸汽浴或80℃干燥箱 加热3~5min,剧烈摇动锥形瓶,
使氧化铝可以自由流动,无结块。冷却,静置30分钟,使水分分 布均匀。
(3) 验证处理过的氧化铝:取标准应用液1.0ml,用氮气吹干,再用石油醚溶解定 容至1.0ml。
然后按5.3装柱,将标准溶液加入柱上,按5.4净化步骤进行柱色谱,用旋转蒸发 瓶收集洗
脱流出液,浓缩,氮气吹干,用正己烷定容至1.0ml,HPLC测定,记录峰面积或峰高( A)。
另取标准应用液直接测定,记录峰面积或峰高(Ar)。将A与Ar进行比较,其值在0.97~
1.03之间(AAr),则说明柱效较好,氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处理。如果
再次验证比值仍不能达到0.97,则需重新制备氧化铝。
3.14 维生素K1标准:Sigma公司,纯度>98%。
3.15 标准贮备液:精确称取50.0mg 维生素K1标准,用正己烷溶解定容至50.0ml,即
1.0mgml。将储备液分装成安瓿,冷冻保 存。
3.16 标准工作液:取标准贮备液, 用正己烷准确稀释50倍, 即20.0μgml。
标准工作液的标定:取标准应用液测定紫外吸光值,波长248nm,比色杯厚度1cm,以正己
烷为空白,测定3次,取平均值,按下式计算标准应用液浓度。
A
X1 =--------×M ×103 ……………………………………(1)
E

式中: X1 -- 维生素K1标准应用液浓度,μgml;
A -- 标准应用液平均紫外吸光值;
E -- 摩尔消光系数,20,000;
M -- 维生素K1分子量450.7;
103 -- 换算成μgml的换算系数。
5.操作步骤
所有操作均需避光进行
5.1 样品处理
(1) 新鲜蔬菜:拣净去杂物,将可食部洗净,擦去表面水分,切碎,用打碎机制备成匀浆。
(2) 干制植物性样品:磨碎,过60目筛。
5.2 样品提取
(1) 称取已打成匀浆的新 鲜样品2~10g(维生素K1含量不低于2μg),加到具塞锥形瓶
中,再加入5~10倍体积的丙酮 ,盖上塞子,振摇3~5min,静置1min,以下按5.3步骤操作。
(2) 称取干制植物性 样品0.2~4g(维生素K1含量不低于2μg),加到研钵中,再加入2~
4倍于样品量的无水Na 2SO4研磨均匀后,加入25ml丙酮,研磨3~5min,静置1min。
(注:对于细胞壁比 较厚的样品,如藻类食品,可先用石英砂研磨,破坏植物组织细胞。石
英砂需进行预处理,将石英砂用2 0目筛子过筛之后,先用浓盐酸浸泡,然后再用稀氢氧化
铵浸泡,最后用蒸馏水洗至中性后在烘箱中烤干 。使用时,每10g样品加3~5g石英砂于研
钵中研磨。)
5.3 洗涤
将上部澄清液倒入已装有50~100ml 0.14molL Na2SO4溶液的分液漏斗中,残渣 再用丙酮
提取2~3次,每次用量不少于25ml,上清液并入分液漏斗。残渣继续用石油醚洗涤3~4
次,每次用量约25ml,至洗涤液呈无色,将洗涤液倒入同一分液漏斗中,振摇1min,静置。弃水相,有机相用蒸馏水洗涤4~5遍,至水相澄清。弃水相,将有机相经无水Na2SO4脱
水后 转至旋转蒸发瓶中,于60℃水浴中减压蒸馏至约2ml时取下,立即用氮气吹干,用石
油醚定容至2. 0 ml,待净化。
5.4 装柱
取干燥色谱柱,将验证好的氧化铝浸泡于石油醚中, 湿法填充于色谱柱,使氧化铝自由均匀
流下,至柱高为20cm,其上端再加2 cm无水Na2SO4。打开活塞,调整流速为每秒1滴。
一根色谱柱只用于一个样品测定。
5.5 色谱净化:待石油醚流至柱上端0.5cm时,加V1 ml样品提取液,当样品液流至柱平齐
时,加2 ml石油醚冲洗柱壁,流下。再加10ml石油醚洗脱,2次,弃除流出液。然后,用
30 ml洗脱液 洗脱,用旋转蒸发瓶收集流出液。流出液于旋转蒸发器浓缩近干,取下用氮气
吹干后,用正己烷定容为V 2 ml。将定容液移入小塑料离心管中,5000rpm离心5min,上清
液供HPLC分析。
5.6 标准工作曲线的绘制
分别取维生素K1标准应用液0.5,1.0,2.0,4. 0,6.0,8.0,10.0ml,加入分液漏斗中,按
5.2步骤提取,浓缩定容至2.0ml。取 1.0ml标准提取液按5.4步骤操作,最后定容至1.0ml,
即标准工作曲线中各点维生素K1含 量分别相当于5,10,20,40,60,80,100μgml。然
后再按5.6条件进行HPLC 测定,记录峰面积或峰高。以标准含量为横坐标,峰面积或峰高
为纵坐标绘制标准工作曲线。
5.7 HPLC色谱分析
色谱条件(推荐条件):
预柱ultrapack ODS,10μm,4.0mm×4.5cm。
分析柱:ultrasphere ODS,C18,5μm,4.6mm×250mm。
流动相:甲醇+正己烷(98+2)。混匀,临用前脱气。
进样量:20μl。
流速1.5mlmin。
紫外检测器:波长248nm。量程0.01~0.05。 < br>HPLC稳定性的测定:取标准应用液连续进行6次HPLC测定,计算峰面积或峰高的平均值、
标准差和RSD%,如果RSD<1%,说明仪器稳定性良好。仪器稳定后方可进行样品测定。
5.8 样品分析
取样品净化液20μl,按色谱条件进行定性、定量分析。
(1) 定性:用标准色谱峰的保留时间定性。
(2) 定量:用样品峰面积或峰高在标准工作曲线上查出其相应的维生素K1含量,或用回
归方程求出其含量。
6.计算
c×2×V2 ×100
X2= ----------------- ………………………(2)
V1×m

式中: X2 -- 样品中维生素K1的含量,μg100g;
c -- 由标准工作曲线上查出或回归方程求出的维生素K1含量,μg;
2 -- 样品提取后的定容体积,ml;
V1 -- 样品净化处理时的取液量,ml;
V2 -- 样品净化后的定容体积,ml;
m -- 样品质量,g。
7. 注意事项
(1) 7.1允许差及最小检出量: 同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10%,
本法最小检出限为0.5mg。
(2) 本方法避免使用皂化处理,减少了维生素K1的破坏;利用失活的磷酸盐处理过的氧
化 铝进行色谱分离,通过改变洗脱液的极性使维生素K1与杂质分离,有利于高效液相色谱
对维生素K1的 定性及定量分析。
(3) 维生素K1具有很强的亲脂性,溶于丙酮、石油醚、正己烷、异辛烷等溶 剂中,而不
易溶于甲醇、乙醇等溶剂中。当样品中含有较多的水分时,如直接用石油醚或正己烷提取会< br>使样品变粘,因此,样品需先用丙酮提取,或先用无水Na2SO4研磨,然后再用丙酮提取,
可 起到吸收水分的作用,进一步地破坏样品的细胞组织,使提取效果更佳。
(4) 以往的报告多选用 活性硅胶或中性氧化铝做色谱柱分离维生素K1,再用极性小的有
机溶剂作洗脱液。实际工作中发现,用 硅胶色谱柱,洗脱流速慢,洗脱液用量大,分离时间
较长;用未经处理的氧化铝色谱柱分离会出现维生素 K1与干扰物分离不清的现象。当氧化
铝用磷酸盐处理后,氧化铝的极性增强,使吸附较小的维生素K1 易于被洗脱液洗脱出来,
而且在处理后的氧化铝中加入少量水分可以提高柱效,减少维生素K1出峰拖尾 的现象,缩
短保留了时间,避免了因使用氧化铝造成的维生素K1可能分解的现象。
(5) 如果氧化铝色谱柱柱效良好,首先被石油醚洗脱出来的应是胡萝卜素,且柱上没有胡
萝卜素黄色带扩散的 现象;叶绿素及其他色素停留在色谱柱的上方没有或仅有少量位移但不
影响分离效果。
(6) 洗脱液中乙醚含量的多少影响着洗脱液的极性,如果乙醚含量少,可使维生素K1的
保 留时间延长,反之,会使干扰物质被提前洗脱,影响净化效果。所以应严格控制洗脱液中
乙醚的比例。
(7) 根据标准维生素K1紫外扫描图谱,可见维生素K1于240,248nm,260,269n m波
长处有4个特征峰,其中260nm的峰最低。将标准品用HPLC测定,以260nm波长下的峰
面积为1,则240nm, 248nm和269nm波长下的峰面积分别为1.15,1.23,1.09。
(8) 一般反相 色谱,多用有极性的甲醇作为流动相。在甲醇中加入适量的非极性有机溶剂
(如正己烷、异辛烷等),可 以增加维生素K1 的溶解能力,有利于缩短保留时间,减少出
峰拖尾现象。本方法选择甲醇+正己烷( 98+2)作为流动相,维生素K1的保留时间为
15.6±0.1min。
(9) 本方 法最小检测限为0.5μgml,在1.0~100.0μgml范围内与峰面积有良好的线形关系。
批 间测定结果的相对标准偏差在1.3~7.1% (n=6);回收率为90.9~106.3%。。不同实验< br>室间测定结果表明此方法精密度、重现性较好,净化效果好,试剂价格适中。
二、食物及饲料中水溶性维生素K3(甲萘醌)的测定方法
1.原理
在氨存在 的条件下维生素K3(甲萘醌,VK3)与氰乙酸乙酯形成蓝紫色物质,在575nm下
的吸光度值与维 生素K3的浓度成正比,用分光光度计测定有色物质的吸光度值,定量分析
样品中维生素K3的含量。本 法检出限为0.05mg。
2.适用范围
本方法适用于强化食物及饲料中水溶性维生素K3的测定。
3.仪器
分光光度计
4.试剂
本实验所用试剂均为分析级,实验用水为蒸馏水。
(1) 0.1molL碘溶液:称取25g KI 溶解于20ml水中,加入9.8g碘,混匀溶解 ,加水至
750ml。贮存于棕色瓶中,避光保存24h。
(2) 0.1molL硫代硫酸钠:将水煮沸后冷却。称取25g Na2S2O3·5H2O溶解于500ml含
0.1g Na2CO3 的冷却水中,并用冷却的水稀释至1000ml 。
(3) 淀粉指示剂:称取2g可溶性淀粉,加于10ml水中,摇匀。然后缓慢加至200ml沸水
中,煮2 min。
(4) 氨水+异丙醇(1+1)溶液:取异丙醇与等体积的浓氨水混合。
(5) 氰乙酸乙酯(30gL):取3g氰乙酸乙酯溶解于100 ml异丙醇中。
(6) VK3标准溶液(0.1 mgml):准确称取50mgVK3标准品,转至500ml棕色 容量瓶中,
用异丙醇溶解并定容至刻度。
5.测定步骤
所有操作均需避光进行
5.1 提取:准确称取约15g已混匀的样品,准确加入100ml水,搅拌10min,保证VK3 充分
溶解与混匀。过滤,如滤液浑浊,则反复过滤至澄清。
5.2 氧化:吸取40ml滤液至100 ml容量瓶中,加1~2滴淀粉指示剂,用0.1molL碘溶液
滴 定,至出现持续的蓝色。向溶液中滴入1滴0.1molL Na2S2O3消除蓝色。用水定容至刻
度。
(注:碘溶液的作用是作为氧化剂氧化样品中 的还原性物质,多余的碘溶液可使淀粉变成蓝
色,Na2S2O3则是去除多余的氧化剂,消除兰色,以 避免有色物质影响测定。)
5.3 标准管和样品管的制备:分别取2套20ml比色管,分别按表 1顺序加入VK3标准溶液、
样品提取液及试剂,制备标准管和样品管。

表1 标准管和样品管的制备

试剂 标准管 样品管
0 1 2 3 4 空白管 测定管
----------------------------------- ------------------------------
VK3标准溶液,ml
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
-
-

样品提取液,ml
-
-
-
-
-
10.0
10.0

异丙醇,ml
3.0
1.50
1.0
0.5
0.0
3.0
2.0

乙基氰乙酸,ml
-
1.0
1.0
1.0
1.0
-
1.0

氨水-异丙醇,ml
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
----- -------------------------------------------------- --------------
用水定容至20ml,摇匀,放置20min。


(注:样品管和标准管中水定容的体积与显色强度、显色的稳定时间密切相关,如果定容体
积过少,则色度较弱,且稳定时间短。如按本方法的操作进行,显色反应至少可以稳定2
小时。
5.4比色测定:用分光光度计于575cm波长下,以标准0管做空白管,调节仪器零点,测定
各管吸光度值。
6.计算
以标准VK3含量作横坐标,吸光度值作纵坐标,绘制标准 曲线,并计算回归方程。用样品
测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线上查出样品管的VK3含量, 然后计算出样品中
VK3的含量。

Ca - b ×25
X= ------------- ×100
m

式中:
X --样品中VK3的含量,mg100g;
Ca - b -- 样品测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线上对应的VK3含量,mg;
M --样品质量,g
25 ── 样品稀释倍数;
7.注意事项
(1) 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值<10%。
(2) 天然食物中不含有维生素 K3,只有部分强化食物可能用VK3作为强化剂。有文献报
道人工合成维生素K3可能有一定的毒副作 用,尽管目前还没有有力的证据支持这一论点,
但是现在市场上应用维生素K3作为强化剂的产品较少见 。饲料常用维生素K3作为维生素
K 的来源,所以维生素K3的测定对饲料检测和质量控制更有意义。

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