鬼剃头怎么治双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)实验设计

2021年1月5日发(作者：儿童吃钙片什么牌子好?已解决)
双抗体夹心一步半法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)
【技术背景】
目前检测HBsAg的技术有：①两位点一步法：可出现钩状效应，待测抗原浓度过高出
现假低值或假阴 性；②两步法：无钩状效应；③一步半法：减少钩状效应。
本实验所采用的方法为一步半法 ，此法是基于抗原抗体特异性反应的原理，因此对于
所检测的抗原其对应的抗体是特异性的，待测抗原必 须存在于抗体结合的抗原决定簇，因此，
此法用于乙肝表面抗原是比较准确的。
【病人准备】
虽然在进行乙肝表面抗原检查前没有空腹检查的要求，但检查前一天应注意不喝酒、不
服用任何 对检测结果有影响的药物。
【标本的采集与保存】
血清：采用正确医用技术采集静脉血2m l，待血液自然完全凝固后，2000-3000转分
离心10分钟，取新鲜血清用于检测。
血浆：用抗凝血浆管（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一作抗凝剂）采集静脉血2ml，
3000-35 00转分离心10分钟，取新鲜血浆用于检测。
血清样品：5天内测定，可以放置于4℃；超过一周，-80℃保存
2.实验前准备
1） 用前三十分钟从冰箱中取出的试剂盒和待测标本，平衡至室温（18-25℃）；
2） 将恒温箱或恒温水箱调至反应温度。
【原理】

将抗HBs 的单克隆抗体（简称单 抗）或多克隆抗体（简称多抗）包被于聚苯乙烯微孔
板等固相载体上，加人待测血清和酶标记抗体（抗H Bs-HRP），血清中HBsAg与微孔板上
的包被抗体（抗HBs）结合，洗涤分离后，加人酶底物 系统，留在微孔板表面抗HBs-HBsAg-
抗HBs-HRP复合物中的HRP催化底物进行显色反 应。根据显色反应颜色的深浅（吸光度A
高低）与血清标本中HBsAg含量成正相关，以此判定血清样 品中HBsAg 的有无及相对含
量。显色为阳性，不显色为阴性。
【试剂与器材】
1.试剂 抗HBs包被的微孔板、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、酶标试剂、浓缩洗 涤
液、显色剂A、显色剂B、终止剂、封板膜
2.器材 加样枪（20μL、50μL -250μL）、恒温设备（恒温水浴箱或恒温箱）、洗板机、
酶标仪、吸水纸、消毒缸
要求：a ）酶标仪在450 nm 和492 nm 的波长不精密度应在≤1 %，分别在449 nm -451 nm
和491 nm-493 nm 之间，吸光度（A 值）要求可以测到小数点后两位；
b ）移液系统在100μl和50 μl 的移液不精密度应≤1 % ，分别在99- 101μL和
49.5μL-50.5μL 之间；
c ）恒温系统在37 ℃ 、43℃ 的温度变异应成±1℃ 。
【操作方法】

1.编号
将微孔板按序编号。每批实验应设阴性对照3孔、阳性对照2孔、空白 对照1孔，其
余为待测血清孔（3孔）。
2.加样品稀释液：每孔加入样品稀释液20μL或一滴，空白孔不加。
3.加样：在待测血 清孔、阴性对照孔和阳性对照孔中加入相应血清100μL孔。轻轻振荡混
匀。
4.温育：用封板膜封板后，置37℃温育60min。
5.加酶标物：小心揭掉封板膜，每 孔加入酶标试剂50μL或1滴，空白孔不加。轻轻振荡混
匀。
6.温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min。
7.将浓缩洗涤液用新鲜蒸馏水或去离子水稀释20倍后备用。
8.洗板：小心揭掉封板膜， 手工洗涤5次，每次都要在吸水纸上尽量拍干或用洗板机洗涤5
次，最后一次尽量扣干。
9.显色：每孔加显色剂A和显色剂B各50μL或1滴，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30min。
10.比色测定：每孔加终止剂50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪主波长为450nm，次波长630nm，10min内测定各孔吸光度（A）值
【结果判定】
1．临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照孔A均值×2.1 （阴性对照孔A值低于0.05
者，按0.05，高于0.05按实际A值计算计算）
2.计算S CO比值（S为样品A值）
3.阳性结果：样品A值≥CO值或S CO ≥ 1为HBsAg阳性
4. 阴性结果：样品A值＜ CO值或S CO ＜ 1为HBsAg阴性
5.有效性判断：阴性对照孔A值≤0.1，阳性对照孔A值≥0.8。否则试验无效。
【 质量控制】
室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ngml、2 ngml，均购自卫生部临 床检验中
心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录SCO值。
一、 分析前质量控制
1、标本采集：规范操作意识；防止溶血；要正确使用抗凝剂和真空采血管；
2、标本处理：及时分离血清或血浆；高危标本应注明；标本闭光、应专人运送。
二、分析中质量控制
1、试剂、校准品和耗材必须取得国家相关部门的批文，在有效期内正确 使用，妥善保
藏，质检;
2、选购高质量、有批文的仪器设备，要正确使用、定期检查、维护和保养，使其在最
佳状态下运转；
3、实验室内检测结果比对：一个实验室对同一项目用不同方法，试剂，仪器，或在不
同地点进行检测，需对不同方法，试剂，仪器，不同地点的检测结果进行比对；
4、严格规范操作程序：HBsAg测定项目和仪器应有SOP，并严格遵守；
5、保持检测 系统的完整性和有效性，对检测系统的精密度、准确度、可报告范围、参
考区间等性能进行核实、确认和 评价；
6、对于脂血、溶血标本应采取一定措施，做室内质控和室间质控；
7、室内质控应连续每天监测，且试验时带质控物随标本一起测定，并对质控结果进行
分析判断。
三、检验后质量控制
1、检验结果的审核和发放：评价HBsAg的测定结果与检验对 象的符合性；根据检验结
果是否需要作其他补充检查；有无异常结果；应对检测系统和检验过程进行评审 ，以保证
检验结果的真实性和可靠性；判断标本的检验结果是否可靠，检验报告是否可发出。
2、室间质量控制：每年参加卫生部、省以市级临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的
质量评价。

【影响因素与注意事项】

（1）标本：①乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检 材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于
混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断 见其具体要求。
②血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小
时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
③采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在3 7℃孵育0.5～1
小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。
④不使用任何热处理过的标本，严重溶血或脂血标本不能使用。 高浓度RF、
高胆红素、溶血、高脂等标本可能干扰实验，应避免使用。
⑤.存放：样本于2 -8℃可储存一周；样本长期储存应放置于-20℃或-20℃以下环
境中，且不宜反复冻融。
（2）试剂盒：试剂盒从冷藏环境中取出，应平衡至室温后再使用。不同批号或不同厂商的
试剂切勿混 用或互换。
（3）检测： 检测必须符合国家有关HBsAg检测的实验室管理及安全的规定，并按有 关规
定处理所使用组分及样品。
（4）加标本和试剂液时应准确加入，且经常对加注器进行校 正。不同试剂分开加入，避免
交叉污染。。
（5）温度、时间： 严格控制反应温度和时间，并尽量使用移液器加样，结果判定以酶标仪
读数为准。
（6）洗板结束后，必须立即进行下一步，不可使酶标板孔干燥。封板膜不能重复使用
（7）显色时必须现加底物液，后加显色剂液，以免显色过低。
（8）所有样品、废液和废弃物都应按传染物处理。
（9）酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振 荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责技术校
准过的，符合实验标准。
（10）尽可能排除干扰因素对试验的影响。干扰因素及变异的潜在来源 ：以下类型的冻融
过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，I gM骨髓瘤，
怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性 ，抗-HSV
阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性 。