小鸡进行曲人口腔粘膜上皮细胞的培养及生物学特性的研究(精)

2020年12月29日发(作者：为什么紫草膏要慎给宝宝用)

人口腔粘膜上皮细胞的培养及生物学特
性的研究




〔摘要〕目的：探讨口腔粘膜上皮细胞的培养扩增方法及生物学特性。方 法：
取手术中切除的多余粘膜，分别用胰酶和Dispase分离后经胰酶消化，接种无
血清培 养基。将二者细胞数量、活力及融合时间加以比较，同时对细胞各代增
殖特点、生长曲线、克隆形成率及 血清对细胞分化的影响进行观察。结果：
Dispase分离法的细胞总数，活细胞数均高于胰酶分离法 。粘膜上皮细胞能够
在无血清培养基稳定增殖传代，血清对上皮细胞有诱导分化作用。结论：
D ispase分离的无血清培养技术可短期内获得大量具增殖能力的粘膜上皮细
胞。
关键词 粘膜；细胞培养；上皮组织细胞
中分类号：R329.2
+
8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0288-03
A study of human oral mucosal epithelial cell culture and
characteristics

Ding Guicong,Mao Tianqiu,Yang Weidong,et al.
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological
College,Fourth Military Medical University,Xi'an,710032)
〔Abstract〕Objective:To study the optimal procedure for the culture
and amplification of oral mucosal epithelial cells (OMEC) and their
biological s:OMEC were primarily cultured with
trypsin or dispase biological characteristics of the
cells were observed through phase microscope,cell growth curve,colony
forming s:More viable cells were harvested with
dispase digestion and the cells reached confluence earlier than with
trypsin third passage of OMEC grew well in
keratinocyte- serum free medium(K-SFM),OMEC were induced to
differentiate when serum existed in sion:A large number
of OMEC may obtained with dispase digestion and the cells grow well
in K-SFM.
Key words Mucous membrane;Cell cultivation;Epithelial cell.
口腔颌面外科的肿瘤切除，创伤及 修复前的牙槽外科往往有大面积口腔粘
膜缺损。自体粘膜移植修复是更为符合口腔生理要求的方法，但组 织来源有
限，因而传统上多采用自体皮肤移植代替缺失的粘膜。皮肤移植修复口腔缺损
的同时， 存在着明显的缺陷
〔1〕
。近年来发展起来的组织工程技术为此问题的解
决开辟了新的 途径。通过体外表皮细胞大量扩增而合成的人工皮肤目前已成功
地应用于烧伤患者。因而如何利用组织工 程方法合成粘膜来代替皮肤移植修复
口腔粘膜，已引起学者的兴趣
〔2〕
。粘膜组织工 程首先要解决种子细胞来源，保
证获得足量且纯化的上皮细胞，而该问题的解决关键是建立可靠的上皮细 胞培
养扩增技术，国内该方面的研究尚少
〔3,4〕
。本研究目的是研究无血清培养条 件
下粘膜细胞的培养扩增方法及生物学特性，为粘膜的体外构建奠定基础。
1 材料和方法

1.1 材料
人角朊细胞培养液（K-SFM， Gibco），胰酶
（Sigma）,DMEM(Hyclone),Dispase II(Gibco)，胎牛血清（浙江金华清湖犊牛
利用研究所)。
1.2 方法
1.2.1 标本处理 无菌条件下收集本院颌面外科手术中丢弃的多余粘膜，患者
年龄2.5 ～62岁。置于体积分数为10%血清的DMEM 中。PBS洗净血迹，2.5
gL洗必泰液浸泡5～8 min，尽量去除粘膜下组织，并切成0.3 cm×1 cm大小
的组织块。
1.2.2 标本分组 每个标本分成相等两份，其中一份放入2.5 gL Dispase
II溶液,4 ℃冰箱过夜；另一份则置2.5 gL胰酶4 ℃冰箱过夜，两组分离时
间相同。然后用眼科镊将表皮撕下，将两组的上皮分别用2.5 gL胰酶37 ℃
消化5～10 min，DMEM（含血清）中止消化，吹打成单细胞液。血球板计算细
胞数 ，台盼兰活细胞计数，以4×10
4
个cm
2
的细胞密度接种于含K- SFM的25
ml培养瓶中。
1.3 观测指标
1.3.1 倒置显微镜下观察各代细胞形态。
1.3.2 细胞计数及台盼兰活力染色比较两种酶分离的特点。
1.3.3 细胞生长曲线并计算群体倍增时间 取第2代正常粘膜上皮细胞，以
10
4
个cm
2
的细胞密度接种24孔板，每一组为3孔，定期用胰酶消化计数，取3孔的平均数，绘制生长曲线，并计算群体倍增时间
〔9〕
。
1.3.4 细胞克隆形成率 将第二代粘膜上皮细胞用胰酶消化，分别以10
2
、
10
3
、10
4
个cm
2
的细胞密度接种培养瓶内，7 d后倒置显微镜下观察含10个以
上细胞克隆数并计算克隆形成率
〔5〕
。
1.3.5 血清对细胞生长的影响 培养瓶内细胞融合达60%时，加入含体积分数
10%胎 牛血清的角朊细胞培养液，显微镜下观察细胞的生长状况。
2 结 果

2.1 粘膜上皮细胞各代形态学观察
粘膜上皮细胞接种K-SFM，可连续传4～5代。消化后细胞大小 不一，小而
圆的细胞为具增殖能力的基底细胞。细胞逐渐沉降，贴附培养瓶，这一过程持
续48 h以上。贴壁细胞渐变为卵圆形，伸出突起，胞浆透亮，边界不明确。从
第4、5 天上皮细胞开始增殖，融合时间因分离酶而有差异。Dispase组在接种
后10 ～14 d融合，而胰酶组则需13～18 d。第二代与第一代相似，细胞增殖
力强。第三代可见少许体积大的 细胞，第四代巨型细胞的数量约占10%左右，
融合时间延迟。第五代则以巨型细胞为主，胞内出现颗粒 ，增殖缓慢，细胞甚
至变圆，脱落死亡。Dispase组未见成纤维样细胞污染，而胰酶组则混有成纤
维细胞，随传代次数增加成纤维细胞的比例增加。年轻患者来源的上皮细胞增
殖快，融合早。老 年患者的上皮细胞在原代培养即出现一定数量的巨型细胞，
传代后巨型细胞的比例明显增加，有的仅能传 3代。另外在克隆形成过程中，
克隆中心与周缘细胞分化不一致。中心部位呈多角形，出现复层，周边细 胞则
为单层，仍呈卵圆形，处于增殖状态（1)。

1 粘膜上皮细胞 ×100
2.2 两种酶分离效果比较
两组消化后细胞数量，活力比较(表1)。
表1 不同酶分离消化法对细胞活力、细胞数量影响
方法
胰酶
n=6 ①<0.01
2.3 细胞生长曲线、克隆形成率及群体倍增时间
2示上皮细胞的生长曲线。接种的上皮细胞有明显的迟滞时间，一般为3
d。随后细胞开始增殖活动，在细胞发生接触抑制前有3～4 d的线性生长阶
段。细胞群体倍增时间平均为49.6 h，但细胞群体倍增时间与开始接种密度明显相关，个体间也存在着较大的差异。上皮细胞最低接种密度大于1×10
3
个
c m
2
才能形成克隆，最适接种密度为1×10
4
个cm
2
, 平均克隆形成率为21.5%。

2 粘膜上皮细胞生长曲线
2.4 血清对上皮细胞的作用
对接近融合的上皮细胞，在K-SFM加入体积分数10%的血清，与单纯 应用
K-SFM的细胞的相比，上皮细胞分化程度明显高，细胞由卵圆形变为多角形
状，复层上 皮的范围增大，而且在复层上皮中央可见角化物。
细胞数 活细胞比例
融合天数
（×10
6
cm
2
） （%）
1.7±0.19 78±4 15
12 Dispase+胰酶 2.2±0.26
①
89±3
①

3 讨 论

1975年Rheinwald和G reen提出用3T3细胞作滋养层培养上皮细胞后，这
一方法已被广泛应用于培养各种上皮细胞。对口 腔粘膜上皮细胞的培养也多采
用这一技术
〔1,2〕
。但由于该培养法利用血清培养基 ，血中的某些成分可能对实
验结果有干扰作用，而且3T3细胞作为异种蛋白可能对人有不利的影响〔6〕
。本
研究中在细胞培养时，加入含血清的培养液，发现部分单层上皮细胞出现复层< br>并有角化物出现，这说明血清成分对上皮细胞有诱导分化的作用。提示在细胞
扩增传代时加入血清 是不利的，可使细胞传代次数减少。近年来发展起来的无
血清培养法则可避开这些缺点，无血清培养尚可 抑制成纤维细胞增殖，促进上
皮细胞生长，因而有利于组织工程粘膜的构建与临床应用
〔7〕< br>。关于口腔粘膜上
皮细胞的培养国内研究较少，且仅为采用含血清培养基进行的原代培养
〔3,4〕
,在
无3T3细胞存在时难以传代，不能满足组织工程对细胞数量的需要。本实验利
用无血清培养基，细胞可稳定传代4 ～ 5代。从各代增殖特点看，前三代细胞
增殖能力强， 第四代出现一定比例的巨细胞，第五代细胞则衰老。因而从组织
工程的角度，本研究支持采用培养的第三 代细胞，既满足一定数量，又保证细
胞有良好增殖能力。粘膜上皮细胞的传代数与接种细胞数密切相关。 形成克隆
的适宜细胞浓度为1×10
4
个cm
2
,过低的细胞数量使 细胞不能自我支持，因为细
胞生长尚需依赖细胞本身的局部分泌生长因子。而且过低的细胞接种数使传代
次数明显减少，这对大量扩增上皮细胞是不利的。融合时间及传代次数因供体
年龄而有所不同， 这与随年龄增加，受细胞生物钟的影响，细胞寿命变短，增
殖能力降低有关
〔5〕
。实 验观察到老年患者来源的细胞在同样接种密度下与40
岁以下相比，传代次数多低于4代。有研究利用1 cm
2
皮肤，经体外培养扩增
后利用第二代细胞至少可获得1000 cm
2
皮片，短时间内获1000倍的组织。本
实验Dispase组原代少量粘膜可以获得1～2 ×10
6
个细胞，第二代则有1～
1.5×10
7
个细胞，可满足 体外在一定时间内大量扩增和有关细胞学的研究。
人口腔粘膜上皮细胞培养关键的一步是上皮细胞 与成纤维细胞的分离，有
效的分离可避免成纤维细胞的污染
〔2〕
。传统上使用胰酶时 在破坏半桥粒的同时
又破坏桥粒，因而易造成基底层细胞的丢失。而Dispase是一种中性蛋白酶，
仅作用于表皮与真皮结合处，破坏半桥粒结构，使基底细胞层底完整分离
〔8〕
。基底细胞是上皮中唯一具有增殖能力的细胞
〔6〕
，Dispase完整保留基底细胞层< br>的特点意味着Dispase法获得基底细胞数比胰酶分离法多，故增殖细胞的数量
就多。此外， 胰酶尚可分解细胞膜上的大分子蛋白质，使细胞通透性升高，细
胞活力下降，台盼兰细胞活力染色表明， Dispase消化的活细胞数明显高于胰
酶法，因而一般Dispase组融合也较早。关于上皮细胞 培养中成纤维细胞的污
染，在Dispase组中未见污染，而胰酶组则有成纤维细胞混入，长期培养则 需
进一步纯化细胞，而目前尚无理想的纯化方法
〔3,9〕
。
因而，本实验结果支持采用Dispase II分离法的无血清培养技术，在短期
内稳定地获得大量纯 化的上皮细胞，可初步满足组织工程化粘膜的培养需要。
作者单位：丁桂聪(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032)
毛天球(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032)
杨维东(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032)
陈富林(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032)
赵晋龙(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032)
陶凯(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032)
参考文献
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收稿：1999-12-28
修回：2000-04-28