三种消化酶测定

2020年12月14日发(作者：颜昌贵)
..
蛋白酶活力的测定

[目的与原理]
掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、 虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等蛋
白酶的活力。
动物消化器官内含有各种消 化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄入
的大分子营养物质转变为可溶性小分子物 质而吸收进入血液循环。本实验采用福林—酚法测
定机体内主要消化酶—蛋白酶活力。福林—酚试剂（F olinphenol）在碱性溶液中极不稳定，
易被酚类化合物还原为蓝色化合物。蛋白质中含有酚基 的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯
丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福 林－酚试剂成蓝色反应，
可从蓝色的深浅测知酶活力多少。
[试剂与器材]
试剂：
1、福林试剂：在2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na
2
WO
4< br>·2 H
2
O）100g，钼酸钠
(Na
2
MoO
4
·2H
2
O)25g，水700ml，35％磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火 回流10小时，然后加
人硫酸锂50g，水50ml和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸15分钟 ，以除去多余的
溴。溶液呈金黄色，冷却后，定容至1000ml，过滤，滤液即福林试剂（试剂不应呈 绿色，
否则需重配）。置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至1N。
2、0.55M碳酸钠溶液
3、10％三氯乙酸
4、0.02M pH7.5磷酸缓冲液：
0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取Na
2
HPO
4
·2H
2
O 3.561g (或Na
2
HPO
4
12H
2
O 7.164g)，溶
解于1L蒸馏水中。0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH
2
PO
4
H
2
O 2.76g (或NaH
2
PO
4
2H
2
O
3.121g)，溶解于1L蒸馏水中。
将0.02M 磷酸氢二钠溶液84ml与0.02M 磷酸二氢钠溶液16ml混合，即为0.02M pH7.5磷
酸缓冲液。
5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5N NaOH 1ml湿润。再加少量0.02MpH7.5磷酸缓
冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至100ml，冰 箱中可保存一周。
材料：
鲜活鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。
器材： 分光光度计、光径1.0cm比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、冰块、
试 管若干、移液管若干。
[实验步骤]
1、酶粗提液的制备
. .下载可编辑 . .
..
取新鲜肝胰脏、 胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水
匀浆各组织，将组织悬液低温 下离心（3000rpmmin）,上清液为酶粗提液（酶液）。
2、酶活力测定
（1）标 准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N盐酸溶解，定容至100ml，
分别配 制溶液0—100μgml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液1ml，加0.5％酪素
0
2ml，于37C 水浴中反应15分钟，然后加入三氯乙酸3ml，离心除去沉淀。取清液1ml，加
0
入0.55M碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37C水浴显色15分钟，在680nm波长 下比
色，测光密度（O D）。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制曲线。
（2）样品测定
样品测定设对照管和测定管。
对照管 测
定管
适当稀释酶溶液 1ml
去离子水 1ml
0
37C水浴预热3---5分钟
0.5酪素（预热过） 2ml 2ml
0
37C水浴准确反应15分钟
10％三氯乙酸 3ml 3ml
离心去除沉淀
取上清液于另外试管内 1ml 1ml
0.55M碳酸钠 5ml 5ml
福林试剂 1ml 1ml
37℃水浴显色15分钟，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。
3、计算
在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位
蛋白酶的活力单位＝A15×F
A为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸μg数
F 为酶液最终稀释倍数，15为反应时间（min）
. .下载可编辑 . .
..
[方法评估]
福林—酚法测定蛋白酶活力是生产实践和科学研究中应用的基本实验方法。
[应用意义] < br>水产动物消化系统内的消化酶随动物种类而异，而且消化酶的种类和在消化道中分布的差别
是和动 物食性相适应的。分析消化蛋白酶活力有助于了解动物对蛋白质食物的消化能力，掌
握动物的营养需求。
[注意事项]
1、实验材料应新鲜，不新鲜会发生组织自溶和酶原被破坏。
2、酶液与底物作用时间、作用温度要严格控制，否则数据误差很大。
3、酶液要用适当缓冲液稀释到测定光密度在0.2—0.6之间。






























. .下载可编辑 . .
..

淀粉酶活力的测定

[目的与原理]
掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产 经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶
活力。
淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键 水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下，反
应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复 合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管
比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。
[试剂与器材]
试剂：
1、0.04%可溶性淀粉
精确称取可溶性淀粉 0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，
另称取无水磷酸二氢钠 13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,
煮沸后，将淀粉混 悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒
入此烧杯内。继续煮沸1分钟， 冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml
刻度。此淀粉液pH应为7.0± 0.1，在室温下保存2―3个月。
2、0.1N碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO
3
) 3.567g及碘化钾（KI ）45g置于1L容量瓶内，
加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀 释至1L刻度，置冰箱内
备用。
3、0.01N碘应用液：取0.1N碘贮存液50ml，用 蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱
内约保存1个月。
材料：
新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。
器材：
分光光度计、电子天平、离心机、 pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml
比色管若干、移液管若干，500ml容 量瓶，烧杯。
[实验步骤]
1、酶提取液的制备（见实验蛋白酶活力的测定）
2、淀粉酶活力的测定
取50ml刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。
对照管 测定管
. .下载可编辑 . .
..
0.04％可溶性淀粉 5.0ml 5.0ml
将两管在37℃水浴中预热2—5分钟
酶液 — 0.1ml
测定管混匀后，再置37℃水浴中反应7.5分钟
0.01N碘应用液 5.0ml 5.0ml

用蒸馏水稀释至50ml，立即 混匀。用660nm或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度0
点，读取对照管和测定管光密度读数 。
3、计算
淀粉酶活力单位定义：在37C、30min内，100ml酶液中的淀粉酶能 完全水解淀粉10mg称为
一个淀粉酶活力单位。
淀粉酶活力单位100ml＝（对照管光密 度—测定管光密度）对照管光密度
×210×307.5×1000.1=（对照管光密度—测定管光密 度）对照管光密度×800
[方法评估]
测定淀粉酶的方法有很多种，大致可分为两类：即 测定底物（淀粉）的减少量和测定产物（如
还原性糖）的生成量。本实验采用前者的淀粉—碘比色法。
[应用意义]
分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力，由于鱼虾等水 产动物种类
与大小的差异和所提供食物品质的不同，以及动物所处生活环境的变化，各种水产动物对食< br>物的消化吸收有明显的差别。认识鱼虾消化酶变化特性，为研究水产种类饲料配伍提供科学
依据
[注意事项]
1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml内含淀粉量为2mg，在本法条件下，当 2mg淀粉完全水解时相
当于800淀粉酶单位／100ml（即：210 × 307.5 × 1000.1 = 800）。
2、对照管内含淀粉2mg，由于淀粉溶液比较稳定，故对照管在固定 比色计上的光密度读数
并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。
3、当淀粉酶接近800 单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色，
因此淀粉酶单位较高时（接近600 单位）宜将标本稀释（2～5倍）后重新测定，并将测定
结果乘以稀释倍数。
4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液污染或变质，不能再用。
5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。
0
. .下载可编辑 . .
..


脂肪酶活力的测定

[目的与原理]
掌握脂肪酶活力的测定方法，并测定鱼、虾、贝体内消化器官肝胰脏、胃、肠的脂肪酶活力。
脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘
油一酯及甘油 。水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。
[试剂与器材]
试剂：
1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄榄油乳化液：称取40克聚乙烯醇，加蒸馏水约 1000毫升，在小
火上加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至1000毫升。用双层 纱布过滤，
滤液备用。取4％聚乙烯醇溶液150毫升，加50毫升橄榄油，用高速组织捣碎机搅动6分
钟，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下（4℃）备用。
2、0.025M磷酸 缓冲液（pH7.5）。0.025M磷酸氢二钠溶液的配置：取Na
2
HPO
4·2H
2
O 4.45g
溶于1L蒸馏水中，0.025M磷酸二氢钠溶液的配置 ：取NaH
2
PO
4
·H
2
O 3.45g（或NaH
2
PO
4
·2H
2
O
3. 90g）溶于1L蒸馏水中。将0.025M磷酸氢二钠84ml与0.025M磷酸二氢钠16ml混合，即< br>为0.025M磷酸缓冲液。
3、0.05N氢氧化钠标准溶液
4、1％酚酞指示剂：取1g酚酞溶于100ml 70％乙醇溶剂中。
5、95％乙醇
材料：
鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。
器材：
匀浆器、离心机、 恒温水浴。高速组织捣碎机、酸式滴定管、滴定管架、镊子、剪子、锥形
瓶、移液管、烧杯。
[实验步骤]
1、酶粗提液的制备（见蛋白酶活力的测定）。
2、取100ml锥形瓶3个，一个作为对照组，另两个为测定组
对照组 测定
组1 测定组2
0.025M磷酸缓冲液
（pH7.5） 5ml 5ml 5ml
. .下载可编辑 . .
..
聚乙醇橄榄油乳化
液 4ml 4ml 4ml
95％乙
醇 15ml

40℃水浴预热
5—10分钟
酶
液 1ml 1ml
1ml
40℃水浴保温15分钟（精确计
时）
95％乙
醇 — 15ml
15ml
酚酞指示剂 3滴 3
滴 3滴

用0.05N标准氢氧化钠滴定至微红色，记录滴定用去ml数。
计算：
酶活力以 国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的
酶量定为一个国际单位 。

脂肪酶活力单位＝（A－B）N·f
t
式中： A为样品耗碱液ml数， B为对照组耗碱液ml数
N为每毫升碱液微克分子数，f为稀释倍数
t为作用时间 (分)
[方法评估]
测定脂肪酶活力的方法大致可分为3类：即测定产物（游离脂肪酸）的增加量（如滴定法、
比色 法、分光光度法、荧光法和pH电极法等）；测定底物的减少量（如比浊法、扩散法等）；
测定脂酶的实 际量（如放射免疫法和乳胶凝集法等）。本实验用滴定法测定脂肪酶活力，此
法灵敏度较差，样品用量大 ，但所需设备较简单，可随时进行检测。
[应用意义]
. .下载可编辑 . .
..
脂肪酶是动物消化脂肪的 重要酶类其分泌量和活力与动物对脂肪的消化、吸收、利用有关。
水产动物肝胰脏或胰脏是脂肪酶的主要 分泌器官，胃肠粘膜及肝脏亦能分泌，有的鱼类幽门
垂中脂肪酶活力最高。测定水产动物各部位脂肪酶活 力有助于研究、分析其对脂肪的消化能
力及各部位消化功能状况。
[注意事项]
1、使用聚乙烯醇的聚合度为1000－1750，如聚合度低，乳化效果差。橄榄油乳化液在冰箱
中保 存三天左右仍能保持稳定。
2、反应终了加乙醇可停止酶作用和溶解脂肪酸，以利滴定，乙醇用量以不 低于总容量60%
为宜。
. .下载可编辑 . .