奶牛胚胎移植技术

2020年12月10日发(作者：谢启发)
奶牛胚胎移植技术

上海交通大学农业与生物学院
朱淑文
一、概述
牛胚胎移植的商业化应用开始于七十年代初期。当时，必须通过手术方法才
能采集胚胎，由于奶牛的乳房影响手术的顺利进行，手术后往往还会影响奶牛以
后的繁殖性能，因此，胚 胎移植主要在肉牛中应用。1976年，一些研究小组报
道了应用导管高效采集胚胎的非手术方法。随后 ，胚胎移植在奶牛中的应用得到
了飞速发展。1974年，第一头胚胎移植登记荷斯坦奶牛在美国出生。 七十年代
后期，胚胎移植（ET）登记荷斯坦奶牛的数量每年以100%以上的速度增长，1980年达到8298头年。进入80年代后，随着非手术采胚法和移植技术的改进以及胚
胎冷冻保存技术 的发展，每年（ET）登记奶牛的数量在稳步增长，至1990年达
到18727头年。截止1991年 ，美国登记的胚胎移植荷斯坦奶牛总数量已达到
142598头。目前，44%的荷斯坦优秀种公牛是由 胚胎移植培育的。九十年代以来，
胚胎移植在发达国家中的增长速度有所减缓，但是技术含量越来越高， 例如体外
受精胚胎生产技术、转基因技术以及克隆技术的应用和研究得到加强。近几年来，
胚胎 移植在亚洲和南美一些国家中增长速度很快。从整个世界范围来看，牛胚胎
移植的增长速度仍然很快。
二、胚胎移植技术
（一）体内受精胚的移植
1 超数排卵
在常规胚胎移 植技术中，获得大量可用胚胎的主要途径是超数排卵（简称超
排），因此，高效率的超排技术是胚胎移植 技术能否在生产中推广应用的关键。
应用于奶牛的超排激素主要有PMSG（孕马血清促性腺激素）和F SH（促卵胞素）。
PMSG尽管只需一次性注射，省时省力，但是半衰期过长，可以导致卵巢的过度< br>刺激以及对排卵、受精和随后的胚胎发育产生不利的影响，因此现在一般已不采
用PMSG对奶牛 进行超排处理。目前广泛应用于母牛的超排激素是FSH。用于
奶牛超排的商品FSH均是从屠宰家畜的 脑垂体中提取的，脑垂体不但能够分泌
FSH，而且还能分泌LH，因此商品FSH制剂中都含较高水平 的LH，不同厂家
或同一厂家不同批次FSH制剂中的LH含量差异很大，所以商品FSH制剂的超排效果很不稳定。从理论上讲，在卵泡发育的早期，只有FSH对卵泡生长起启
动和刺激作用，LH 不起作用。只有在卵泡发育的晚期，卵泡颗粒细胞才开始出
现LH受体，此时LH和FSH才起协同作用 ，共同促进卵泡的进一步生长和类固
醇激素的合成。LH和FSH的协同促卵泡生长作用必须有一个合适 的比例，LH
含量过高可以导致生长卵泡的闭锁或黄体化。这一机理就是商品FSH制剂超排
效 果不理想的重要原因之一，国内外的许多报道事例已经证明了这一点。目前，
加拿大生产的超纯度FSH （商品名Follrtropin）是世界公认的最理想的牛用超排
药物。用Follrtropin进 行的大规模商业超排处理结果显示，平均A、B级胚胎数
为8.8枚头次，我们利用中科院动物所提纯生 产的FSH，在北京十三个奶牛育种
场进行了大规模超排试验，试验结果表明：该激素的超排效果有些批 次的效果很
好；有些批次效果不理想。另据报道，牛的超排效果和摄入的营养水平有很大关
系。 奶牛为产奶目的而饲喂的日粮一般为高蛋白低能量日粮，即蛋白水平一般为
17%；但这种日粮不利于奶 牛多出胚胎。为了使奶牛多出胚胎，应降低日粮的蛋
白水平，增加能量水平，最理想的办法是在超排处理 前两周时，将蛋白水平降至
12%，同时补饲大麦、玉米等高能量饲料。此外，在超排前适当补充复合维 生素
制剂也有利于提高牛的超排效果。
超数排卵方法
超数排卵（超排）的 目的时为了增加有活力卵子的数量。通常在供体牛发情
周期的功能性黄体期，一般在母牛发情周期的9～ 14天，肌肉注射PMSG或者FSH，
以刺激卵巢产生额外的卵泡。待处理后供体牛再次发情时静脉注 射LH或者HCG，
以诱导卵泡排卵。但对成年母牛一般不需要外源LH或者HCG。
近年来，由于前列腺素F2α及其类似物如前列烯醇在超排方法上的应用，
增加了超排处理的机动性，可 在供体母牛发情周期的功能性黄体期的任何一天处
理，而且增加了可用胚胎的比例。母牛在PG注射后的 2～3天大多出现发情。
对超排处理的供体牛输精需2～3次，间隔12h，每次的输精量要 大于正常
的输精量，应保证有足够的有效精子。

2．供体和受体牛的准备
供体牛选择的首要条件是其遗传学价值及其健康和繁殖情况，所以，确定供
体前需作必 要的检查，经确定后要加强饲养管理，观察发情，确定正确的发情周
期。每头供体牛需要准备5头受体牛 ，两者的发情开始时间前后相差不超过一天。
在一般情况下，不易找出若干头自然发情 与供体牛发情时间相同的受体
牛，所以在胚胎移植时往往采用对供体与受体牛进行同期发情处理。同时对 供体
牛进行超数排卵处理。

3 胚胎移植
在胚胎移植中，胚胎最终 必须移植到合适的受体牛中才能受胎妊娠，产下优
秀后代，因此受体牛的准备非常重要。在准备受体牛时 ，除了无繁殖疾病等一般
要求外，重点应该考虑发情同期性问题。一般来说，受体牛与供体牛发情同期差
在4!天内时，即发情后第563天的受体牛受胎效果比较理想。许多研究结果证
明，发情时间 早于供体牛的受体牛，其移植受胎率高于发情时间晚于供体的受体
牛，如发情后第3天的受体牛，其移植 受胎率高于发情后第5天的受体牛。其原
因可能是发情后第3天的受体牛，其黄体功能更完善。
综上所述，要提高胚胎移植受胎率必须人同期性上选择合适的受体牛。此外，
对于发情时间稍晚于供体 胚胎日龄的受体（即不到发情后第七天的受体），注射
孕酮有利于受胎。
4 妊娠诊断 （1）直肠检查法通常在移植后1.5～3.0个月进行直肠检查,此时子宫继续增
大，落入腹腔， 可感觉到胎儿的浮动，子宫角出现孕脉,子宫壁可以触到子叶。
（2） 超声波诊断一般可在移植２５ 天后检查,利用探头通过直肠轻轻的在
子宫角上滑动，在荧光屏上可观察到中间灰白色周围黑色的图象— ——胎儿。
（3） 妊娠后的饲养管理在移植后70～90天对受体牛进行妊娠检查，对已
妊 娠的受体要加强饲养管理,避免应激反应。妊娠受体在产前3个月要补充足量
的维生素、微量元素，适当 限制能量摄入，既要保证胎儿的正常发育，又要避免
难产。根据当地的疾病发生情况，有目的地注射一些 疫苗，以防胎儿流产或传染
病发生。

（二）体外受精胚的移植
1 卵母细胞采集和体外成熟培养
将屠宰后的奶牛卵巢用灭菌生理盐水将卵巢洗涤3-5次，除去表面血迹 ，盛
于大烧杯中。用吸水纸将表面擦干。然后用吸有少量采卵液的5ml一次性注射器
和18号 针头，从卵巢表面2－6mm的卵泡内抽吸卵泡液及卵丘-卵母细胞复合体
（Cumulus oocyte complexes，COCs），注意不要将血液混入卵泡液中，以免影
响卵母细胞的 体外成熟和受精。将抽取的卵泡液和COCs注入灭菌试管内，于
38.5℃恒温水浴锅内静置15mi n，弃取上清液，将下层液体倒入直径690mm的
灭菌培养皿内，在体视显微镜下采卵。
2体外受精和胚胎发育
将冷冻精液在38℃恒温水浴锅中溶解，用灭菌吸水纸擦干精液管外水 分，
置于10ml灭菌离心管中，缓慢加获能液至8ml，用2000转分速度离心5min，
去除上清。重复定容离心一次，弃去上清，留置1ml，用血球计数板检测精子浓
度，用受精液将精子浓 度稀释至5－7×10
5
个ml。观察精子活力，并制成0.4ml
的浮游小滴。 < br>将体外成熟的卵母细胞，在受精液中洗2次，每个受精小滴中移入20-25
枚卵母细胞，在CO
2
培养箱中（38.5℃，5%CO
2
，95%空气）体外受精5h后。用成
熟培养液将受精卵洗2次，然后将受精卵转移含卵丘细胞的成熟培养基中，继续
培养（38.5 ℃，5% CO
2
，95%空气）43h。观察卵裂率，继续培养至囊胚，用于移
植或冷冻。

三、 开展牛胚胎移植需要做的准备工作和效益
1 胚胎移植人员的准备：
在牛的胚胎移植中, 供体的超数排卵、采胚、受体的选择、同期发情、发
情鉴定、非手术移植 、胚胎的冷冻和解冻、胚胎的质量评定和分级等, 都需要实
践的积累, 尤其是直肠检查等需靠手感觉 的技术。培养一个熟的技术人员需要
2-3年的时间。本项技术的操作对卫生和无菌要求也较高。由于技 术环节多,环环
相连,一个环节的失误将导致整个操作过程的效率下降和失败。操作过程中的质
量控制和技术把关十分重要。
2 胚胎移植的环境问题：
要有一个能满足胚胎离体条件下短 时间内不被污染和生活能力不受影响的
环境条件,配备相应的仪器设备,适宜而稳定的温度条件等。这些 条件虽然不甚复
杂,投入也不算大,但必须按要求认真设计,购置和安排。
3 胚胎来源：胚胎移植产业化中,最关键的条件之一是要有稳定的胚胎来源。目
前, 国外平匀每次每头供体可生产可用胚6-8枚, 国内一般在6枚左右。只有建
立或确定相应的供体群才 能保证胚胎的供应。其次，可利用胚胎切割和其他胚胎
生物技术, 如胚胎卵裂球和分离培养、性别鉴定等, 增加胚胎的利用率和扩大胚
胎的来源。
4 受体母 牛选择的策略：受体牛与供体牛在遗传和生产性能上相差越大，在牛改
良上意义越大，两者市场价格相差 越大,牛胚胎移植技术的经济汇报越好。在选
择受体母牛时，我们还需要考虑总体效益。利用当地土杂种 母牛作受体，一代换
种，改良效果显著，在农牧区农户饲养时，成本低,投入少，但是如果是舍饲集中饲养，则成本较高。受体牛必须健康,有正常的繁殖力和发情周期，并且发情
天数与供体牛或胚龄 相同。在我国农牧区的条件下，由于营养状况和饲养管理条
件的影响，利用当地黄牛作受体,受胎率通常 低约5-10%。
5 有效的组织工作： 胚胎移植要求各环节的时间及处理程序十分严格，在产业< br>化的实际操作中组织工作非常重要，在某种程度上讲,往往组织工作比技术工作
的难度更大，不重 视这个问题很可能是事倍功半或前功尽弃。工作条件和组织工
作，从技术实施的角度来说，开展胚胎移植 工作只要有供体母牛制作好的胚胎，
一定数量的受体母畜，技术人员和设备即可。目前多数地方的组织工 作并不理想，
工作点分散，可用牛只少，工作效率低，非完善不可。
6 利用胚胎移植技术，提高土种牛养殖的经济效益：
胚胎移植可最大限度地发挥良种母牛的繁殖潜力。母 犊卵巢上约有12万个
原始卵泡以上，10岁左右的母牛卵巢上仍有约25000个卵泡。牛的繁殖周期 较
长,依靠自然繁殖，无论多么优秀的母牛，一生只能产10头左右。利用胚胎移植
技术优秀母 牛每年可获得5—16头后代， 技术水平高者可获得30-50头后代，
超过它一生的繁殖成绩，迅速 扩大良种的数量。用胚胎移植技术可以扩繁良种牛。
从国外或国内购买优秀良种胚胎，直接移植给本地黄 牛，每枚胚胎的价格约1500
元左右，以50% 的成功率计算，每出生一头良种，胚胎费用为300 0元，母牛饲
养费和犊牛饲养费用约为2000元，总成本约为5000元，而到一岁左右的良种牛市场售价约在2万元左右。如果把母牛犊继续培养至18月年龄,进行超数排卵生
产胚胎,每年可生 产胚胎10-20枚,收入约在2万元左右。从国内外购进成年优秀
良种肉牛，通过超数排卵生产胚胎， 移植给本地黄牛，购买成年良种肉牛母牛约
需3万元，每牛可生产膈胎10-20枚,收入约为2万元左 右。利用胚胎移植技术可
大量扩繁奶牛。在我国农区，养牛一般以役用黄牛为主。如果产的牛犊是黄牛犊 ,
一般母牛犊900-1500元，公牛犊约500-1000元。若采用胚胎移植技术,让黄牛怀上奶牛，按目前市场价格小母牛（育成牛）3-8月龄，5000-8000元，母牛8-18
月龄 ，8000-1200元，前三胎经产母牛（带胎3-8个月，带奶），15000元左右。
7 利用胚胎移植技术实现“土牛生金牛”的畜牧经济模式：
1998年，根据农业部科技司推荐的方法计 算，奶用良种胚胎移植后代育
成后，平均每头比土种牛增加的年总经济效益为3.5万元左右。现在全国 年产犊
牛数按5000万头计算，按照每年胚胎移植牛占１%计算，年总经济效益将高达
175 亿元,市场潜力巨大。长期以来,我国养牛以役用为主，奶用为辅，还没有肉
用的专用品种，改良牛的比 例只占30%，生产性能很低，远远不能满足人民生活
水平以及现代农业发展的需要。依靠进口的良种牛 改良土种牛，需要大量外汇，
而利用国内现有成熟的牛胚胎移植技术，既能节约资金，又能加快繁育改良 步伐。
数十年来，我国科学家使用传统育种方式，取得了一定的成果，但品种改良速度
缓慢，不 能使我国牛群品质结构迅速优化，利用胚胎移植技术将大批的黄牛和水
牛改良成“奶牛”，将改变数千年 来中国黄牛和水牛仅做耕牛的状况，使其既可
耕作又可产奶，不仅为广大农民提供了增收新手段，也为中 国百姓提供了更有营
养的乳产品，实现优质种群的迅速扩繁，真正实现“土牛生金牛”的愿望。