乙肝疫苗加强针第五部分和第六部分液体奶和奶品微生物检验方法

2020年11月24日发(作者：冯媛甄)
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第五部分 液体奶微生物检验方法
一、菌落总数的测定……………………………………………第134页
二、大肠菌群的测定……………………………………………第134页
三、芽孢耐热芽孢检验…………………………………………第134页
四、霉菌、酵母菌的检测………………………………………第134页
五、乳酸菌的检测………………………………………………第138页
六、嗜冷菌的检测………………………………………………第139页
七、牛乳美兰还原试验…………………………………………第139页
八、致病菌检验……………………………………………第140页
（一）蜡样芽孢杆菌……………………………………………第140页
（二）沙门氏菌…………………………………………………第145页
（三）金黄色葡萄球菌…………………………………………第156页
九、涂抹检验……………………………………………………第159页
十、空气净度检验………………………………………………第159页
十一、水样检测………………………………………………第159页
十二、无菌奶的检验……………………………………………第159页
十三、半成品的检验……………………………………………第160页
十四、乳制品中乳酸菌益生菌的测定…………………………第160页
十五、志贺氏菌的检验…………………………………………第162页
十六、微生物鉴定………………………………………………第170页
十七、小样发酵法的操作规程…………………………………第175页
一、菌落总数的测定:同冰淇淋微生物检验方法,见116页.
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二、大肠菌群的测定：同冰淇淋微生物检验方法,见109页.
三、芽孢耐热芽孢检验
细菌特殊形态：1芽孢：细菌生长到后期的一种形态（营养不良造成）细胞浓
缩形成。
2荚膜：
3鞭毛：有动力性，用穿刺法（半固体）测
芽孢：一些细菌在其生长后期，在胞内形成一个抗逆性，（ 热、干燥、压力等）
特别强的圆形或椭圆状的原壁厚密的内生孢子称为芽孢。
培养基：锰盐营 养琼脂:每1000ML普通营养琼脂中加硫酸锰
(3.08gMnSO
4
+100m lH
2
O)1ml（注：现化验室用直接配制好的锰盐营养
琼脂混合物，30g加入1 000 ml煮沸的蒸馏水中，混匀，溶解。）

（一）芽孢总数测定

A、样品准备
1. 在无菌操作条件下，将10ml室温状态下的待检样品加入一个灭菌试管中，
盖好棉塞。
2. 在同直径的试管中加入10ml同样室温状态下的水，并插入温度计。
3. 将上述两支试管同时放入水浴中保温，待温度计温度升至80℃时开始计时。
4. 计时达10分钟后，迅速将样品管取出，置于冷水中迅速降温至室温。
5.按无菌操作条件对降温后的样品进行稀释，编号后记录在“微生物检验操作表”
中。
显示目录料选取10
﹣-2
至10
﹣-4
三个稀释度的样品稀释液。
中间产品检验选取10
﹣-1
至10
﹣-2
两个稀释度的样品稀释液 。
问题产品检验选取10
﹣-1
至10
﹣-2
两个稀释度的样品稀 释液。
B、培养基准备
1. 检查预先经过灭菌处理的锰盐营养琼脂培养基是否处于正常、可用状态。
2. 将高压灭菌后的培养基，冷至45℃左右待用。
C、接种培养
1. 在无菌操作条件下，在 一个灭菌平皿内倾入15ml锰盐营养琼脂培养基，并
暴露至接种过程结束，标记后以作为环境对照样品 。
2. 按样品编号在灭菌平皿底部作相应标记，并记录在“微生物检验操作表”中。
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3. 在无菌操作条件下，用1ml的灭菌吸管移取1ml选定的样品稀释液或样品原
样至灭菌平皿内。
4. 同上对同一样品重复操作。即每个选定的样品稀释度做两个平皿。
5. 按以上步骤，以1毫升无菌生理盐水作为空白操作对照。
6. 在无菌操作条件下，将约15ml的锰 盐营养琼脂培养基倾入样品平皿中，将
平皿置于操作台面上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。
7. 待琼脂凝固后，将平皿翻转，即保持有标记和培养基的一面向上。
8. 将所有平皿（包括空白和环境对照）置于36±1℃的恒温培养箱内，保温培
养60---62小时。
9. 在“微生物检验操作表”中记录保温时间。
D、菌落计数
1. 计数原则同菌落总数。计数时认准芽孢菌落，必要时要镜检。记录在“微生
物检验操作表”中。
2. 检验结果=平行样品菌落数之和2x稀释倍数。记录在“微生物检验操作表”
中。
3.
计数结果在100以内，按实际计数报告；100至10000的，按两位有效数
字报告，如果样品只做原液时计数结果在100以外，按实际计数报告。

（二）耐热芽孢总数测定
A、样品准备
1. 在无菌操作条件下，将10ml室温状态下的待检样品加入一个灭菌试管中，
盖好棉塞。
2. 在同直径的试管中加入10ml同样室温状态下的水，并插入温度计。
3. 将上述两支试管同时放入水浴中保温，待温度计温度升至100℃开始计时。
4. 计时达10分钟后，迅速将样品管取出，置于冷水中迅速降温至室温。
5. 按无菌操作条件对降温后的样品进行稀释，编号后记录在“微生物检验操作
表”中。
显示目录料选取10
﹣-2
至10
﹣-4
三个稀释度的样品稀释液。
中间产品检验选取10
﹣-1
至10
﹣-2
两个稀释度的样品稀释液 。
问题产品检验选取10
﹣-1
至10
﹣-2
两个稀释度的样品稀 释液。
B、培养基准备
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1.检查预先经过灭菌处理的锰盐营养琼脂培养基是否处于正常、可用状态。
2. 将高压灭菌后的培养基，冷至45℃左右待用。
C、接种培养
1.在无菌操作条件下，在一 个灭菌平皿内倾入约15ml锰盐营养琼脂培养基，并
暴露至接种过程结束，标记后以作为环境对照样品 。
2. 按样品编号在灭菌平皿底部作相应标记，并记录在“微生物检验操作表”中。
3. 在无菌操作条件下，用1ml的灭菌吸管移取1ml选定的样品稀释液或样品原
样至灭菌平皿内。
4.同上对同一样品重复操作。即每个选定的样品稀释度做两个平皿。
5.按以上步骤，以1毫升无菌生理盐水作为空白操作对照。
6.在无菌操作条件下，将约1 5ml的锰盐营养琼脂培养基倾入样品平皿中，将平
皿置于操作台面上轻轻转动，使样品和培养基混合均 匀。
7.待琼脂凝固后，将平皿翻转，即保持有标记和培养基的一面向上。
8.将所有平皿 （包括空白和环境对照）置于55±1℃（注：培养温度针对特殊情
况可以特殊对待，但各处统一）的恒 温培养箱内，保温培养60---62小时。
9.在“微生物检验操作表”中记录保温时间。
D、菌落计数
计数原则同菌落总数。计数时认准耐热芽孢菌落，必要时要镜检。记录在“微< br>生物检验操作表”中。
检验结果=（平行样品菌落数之和2）×稀释倍数。记录在“微生物检验 操
作表”中。计数结果在100以内，按实际计数报告；100至10000的，按两位
有效数 字报告样品只做原液时计数结果在100以外，按实际计数报告。

四、霉菌、酵母菌的检测
（依据国标GBT 4789.15-2003）
（一）概 念：指食品检样中经过处理，在一定条件下培养所得的1g或者1ml
检样所得的霉菌、酵母菌的菌落总 数。
（二）培养基：
虎红营养琼脂(孟加拉红培养基):
蛋白胨 5g
葡萄糖 10g
磷酸二氢钾 1g
硫酸镁（MgSO
4
·7H
2
O） 0.5g
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琼脂 20g
13000孟加拉红溶液 100ml
蒸馏水 1000ml
氯霉素 0.1g
将上述各成分加入蒸馏水溶 解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解
氯霉素，加入培养基中，分装121
0
C 灭菌20min。（注：现化验室用直接配制
好的虎红营养琼脂混合物，30g加入1000ml煮沸的 蒸馏水中，溶解。）
（三）检测步骤：
1.样品处理 ：

（1）以无菌 操作用称取试样25ml(g)样液注入含有225ml灭菌水的具塞锥
形瓶中，即为1：10稀释液。
（1） 用灭菌吸管吸取1：10稀释液10 ml注入灭菌试管中，另用1ml灭
菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
（2） 用灭菌吸管吸取1：10稀释液1 ml注入含有9ml灭菌水的试管中，
即为1：100稀释液。
（3） 按上述操作做10倍递增稀释液每稀释一次换一根1ml吸管。
2.接种培养：
（1） 选择三个（样品中霉菌酵母菌含量极少时也可选两个，但需要保
留相应对比数据）合适 稀释度，用无菌管吸取1ml于灭菌平皿中，每个
稀释度作2个平皿。
（2）将凉至45。
C左右的虎红营养琼脂培养基注入平皿中约15ml，待凝
固后，倒置于25—28。
C培养箱中，3天后观察镜检，共培养观察5天。
3.计算方法:
（1）菌落形态：A霉菌：毛状，蜘蛛网状，棉絮状，有多种颜色。
B酵母菌：菌落光滑湿润，白或乳白色，较大，时间长表面有皱
缩。
（2）记数：通常选择菌落数在10---150之间的平皿进行计数,同稀释度的两个
平皿的 菌落平均数乘以稀释倍数,即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母菌.稀
释度选择和菌落报告方式可 参考GBT4789.2-2003。
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五、乳酸菌的检测(依据国标GBT 4789.35-2003)
（一）定义：指一群分葡 萄糖，乳糖产生乳酸，需氧或兼性厌氧，无动力，过
氧化氢酶阴性，革兰氏阳性无芽孢杆菌，球菌。
作用：1.刺激胃肠分泌活动
2.增加胃肠蠕动
3.胃肠酸碱平衡
4.抑制胃肠道腐败菌的生长
5.预防、治疗胃肠道病
种类：乳酸链球菌，乳酸杆菌
（二）培养基：
1.改良MC培养基:
大豆蛋白胨 5 g 葡萄糖 20g
酵母浸膏 5 g 乳糖 20g
牛肉浸膏 5 g 碳酸钙 10g
琼脂 15 g 1%中性红溶液 5ml
硫酸多粘菌素B（酌情而加）10万IU 蒸馏水 1000ml
将前七种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调PH=6，加入中性红溶液。分
装烧瓶，高压灭菌1 21
0
C 15-20min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，酌情
加或不加硫酸 多粘菌素B（检样有胖听或开罐后有异味等疑有杂菌污染时，可加
多粘菌素B，混匀后使用）。（注：现 化验室用直接配制好的改良MC混合物， 72g
加入1000 ml煮沸的蒸馏水中，溶解。）
2.改良番茄汁培养基: （改良TJA培养基）
番茄汁 50 ml 葡萄糖 2g
酵母抽取液 5 g 乳糖 20g
牛肉膏 10 g 磷酸氢二钾 2g
琼脂 15 g 吐温50 1g
乙酸纳 5 g 蒸馏水 1000ml
调PH=6.8±0.2 121
0
C灭菌15-20min。
（一） 检测步骤：
1.样品处理和接种培养：基本同于菌落总数的检测，不同的是选择2- 3
个适宜稀释度，所用培养基是凉至45
。
C左右的改良MC培养基，待凝固
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后，倒置于36
。
C +1的培养箱中，培养72+3小时后计数。
2.菌落形态：皿底呈粉红色，菌落呈红色，较小，菌落边缘有乳晕圈。
菌态
杆菌
改良TTA 改良MC
平四底黄色，菌落中均大平四底粉红色，菌落较小,圆形,
小 ，微白色，湿润，边缘红色，边缘似星状。φ2mm±
不太齐，φ3mm±1mm,1mm,周边有淡晕 环
棉絮状。
球菌 四底黄色，菌落光滑。湿四底粉红色，菌落较小圆形红
润，微白色，边缘整齐
（五）菌落计数：
1. 选30——300间的平板计数，同菌落总数。
2. 选5个菌落作证实试验
革兰氏染色G+无芽胞 过氧化氢酶G
—
观察是否淡晕环
3. 计算：35取5个有4个相同 35×45=28 再乘以稀释倍有选举权报数。
六、嗜冷菌的检测：
同冰淇淋微生物检验方法,见119页。
七、牛乳美兰还原试验（依据国标GB 6914-1986）

（一）．原理 牛奶中的微生物分泌出还原酶，使美兰还原而褪色，还原反应的速度和所
存在的细菌数量有关，根据 美兰退色的时间估计牛乳中的细菌总数来评定牛乳
的品质。
注：亚甲蓝的配制：
色，边缘整齐，有淡晕环
6914-1986要求：
称取分析纯美蓝4.9ml， 再100ml容量瓶内加
部分蒸馏水使之全部溶解后定容至100 ml，盖上瓶塞，于冰箱中保存，应在14
日内用完）；
2. 5ml饱和亚甲蓝乙醇溶液（ 2g美蓝加95%乙醇100ml）加195ml水混
匀，稀释好的溶液应在冰箱中保存，且应在一周内 用完）。
（二）．操作步骤
1．用灭菌的10ml吸管吸取20ml被检乳样于灭菌试管内。
2．用灭菌的1ml吸管吸取配好的美兰溶液1ml，塞上塞子。
3．上下倒转试管几次，使其混合均匀。
4．置于37±2℃水浴内，不同时段看美兰退色与 否并记录时间，根据时间长短，
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来判定细菌总数的含量。
（三）计数：
裉 色 时 间
20分钟
20-40分钟
40分钟-1小时
1小时-2小时
2小时-3小时
3小时-4小时
4小时-5小时
相当每毫升牛乳中的细菌总数
＞2×10
7
1.0×10
7
-2.0×10
7
5.0×10
6
-1.0×10
7

4.0×10
6
-5.0×10
6

3.0×10
6
-4.0×10
6

2.0×10
6
-3.0×10
6

1.0×10
6
-2.0×10
6
5小时-5.5小时 5.0×10
5
-1.0×10
6

5.5小时-6.5小时 3.0×10
5
-5.0×10
5
6.5小时-7.5小时 1.0×10
5
-3.0×10
5

＞7.5小时 〈1.0×10
5

（四）注意事项：
1.水浴的水面要应不低于试管内乳样高度
2.严格记录褪色时间
八、致病菌检验：
（一）蜡样芽孢杆菌
（依据国标GBT 4789.14-2003）
1培养基
1.1肉浸液肉汤：按GBT 4789.28中4.1规定。
1.1.1 成分：绞碎牛肉500g、氯化钠5g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾2g、蒸馏
水1000mL。
1.1.2 制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水1000mL，混合后放冰
箱 过夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过
滤，并挤压收集全部滤液，加 水补足原量。加入蛋白胨、氯化钠和磷酸盐，溶
解后校正pH7.4～7.6煮沸并过滤，分装烧瓶， 121℃高压灭菌30min。
1.2酪蛋白琼脂培养基：按GBT 4789.28中4.65规定。
1.2.1 成分：酪蛋白10g、牛肉膏3 g、磷酸氢二钠2g 、氯化钠5g、琼脂15g、
蒸馏水1000mL、0.4%溴麝香草酚蓝溶液12.5 mL、PH7.4。
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1.2.2 制法：将除指示剂外的各成分混合，加热熔解（但酪蛋白不溶解），校正
pH。加入指示剂，分装烧瓶， 121℃高压灭菌15min。临用时溶化琼脂，冷至
50℃，倾注平板。
注：将菌株划线接种于平板上，如沿菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋
白。
1.3动力-硝酸盐培养基：按GBT 4789.28中4.72规定。
5g、牛肉膏3 g、硝酸钾1g、琼脂3g、蒸馏水1000mL、PH7.0。
1.3.2 制法：加热熔解，校正pH。分装试管， 121℃高压灭菌15min。
1.4缓冲葡萄糖蛋白胨水：按GBT 4789.28中3.4规定。
g、多胨 7g、葡萄糖5 g、蒸馏水1000mL、PH7.0。
1.4.2 制法：加热熔解，校正pH。分装试管， 每管1 mL ，121℃高压灭菌15min。
1.5血琼脂培养基：按GBT 4789.28中4.6规定。

豆粉琼脂(PH7.4~7.6)100 mL,脱纤维羊血(或兔血)5~10mL

加热溶化琼脂，冷却50℃,以灭菌手续加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板.亦可
分装灭菌试管,置成斜 面.亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼.
1.6 3%过氧化氢溶液。
1.7甲萘胺-乙酸溶液：按GBT 4789.28中3.17规定。
甲萘胺0.5 g 溶解于2.5moll乙酸溶液100 mL中。
1.8对氨基苯磺酸-乙酸溶液：按GBT 4789.28中3.17规定。
对氨基苯磺酸0.8 g 溶解于2.5moll乙酸溶液100 mL中。
1.9甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基：按GBT 4789.28中4.64规定。
1.9.1 成分：蛋白胨10g、牛肉膏1 g、甘露醇10 g、氯化钠10g、琼脂15g、
蒸馏水1000mL、0.2%酚红溶液13 mL、50%卵黄液50 mL、多粘菌素B100
国标单位 mL 、PH7.4。
1.9.2 制法：将前五种成分加入蒸馏水中，加热熔解，校正pH，加入酚红溶液。
分装烧瓶，每瓶100 mL， 121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷
至50℃，每瓶加入50%卵黄液5 mL及多粘菌素B10000IU，混匀后倾注平板。
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1.10 0.5%碱性复红染色液：按GBT 4789.28中2.8规定。
0.5g 碱性复红染料溶解m L95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释至100mL。如有不
溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清夜备 用。
1.11木糖-明胶培养基：按GBT 4789.28中4.66规定。
1.11.1 成分：胰胨10g、酵母膏10 g、木糖10 g、磷酸氢二钠5g、明胶120g、
蒸馏水1000mL、0.2%酚红溶液25 mL、PH7.6。
1.11.2 制法：将酚红以外的各成分混合，加热熔解，校正pH。加入酚红溶液，
分装试管， 121℃高压灭菌15min。迅速冷却。
2检验和控制
2.1菌落测定：
无菌 操作称取样品25g（mL）放入灭菌搅拌缸内。用灭菌生理盐水或磷酸盐缓
冲液做成10
-1
~10-
5
的稀释液按GBT 4789.2测定。取各个稀释液0.1mL，接
种在两个选择性培养基-甘露醇卵黄多粘菌素（MYP ）琼脂培养基上，用L棒涂
布于整个表面，置36±1℃培养12~20小时，选取适当菌落数的平板进 行计数，
蜡杆芽胞杆菌在此培养基上的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）周围有粉红色
的晕（表 示产生卵磷脂酶）。记数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验，根据
证实的蜡杆芽胞杆菌的菌落数计算 出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，
即得每克（毫升）样品中所含蜡杆芽胞杆菌数。例如：将0. 1 mL10
-4
样品稀释
液涂布于MYP平板上，其可疑菌落为25个，取5个鉴 定，证实4个菌落为蜡
杆芽胞杆菌，则1 g（mL）检样中所含 蜡样芽胞杆菌数为：25×45×10
4
×
10=2×10
6

2.2分离培养：
取检样或稀释液划线分离于选择性培养基（MYP）上，置37℃培养 12~20
小时，挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌落（见3.1）接种于肉汤和营养琼脂做成纯培
养 ，然后做证实实验。
2.3证实试验：
本均为革兰氏阳性大杆菌，宽度在1μm或1μm以 上，芽孢呈卵圆形，不突出
菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。
本菌在肉汤中生长混浊，常 微有菌膜或壁环，振摇易乳化；在普通琼脂平板上
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其菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐。
本菌有动力；能产生卵磷脂酶 和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发
酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧 条件能发酵葡萄糖。
根据蜡样芽胞杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶< br>液化性状的试验，分成不同型别，见表1
表1蜡样芽胞杆菌生化分型
型别
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
生化试验
柠檬酸盐利用 硝酸盐还原
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
淀粉水解
+
+
-
+
-
-
+
-
-
+
+
-
+
-
+
V-P反应
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
明胶液化
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
2.4与类似菌鉴别：见表2
表2蜡样芽胞杆菌与类似菌鉴别
项目
过氧化氢酶
巨大芽胞杆蜡样芽胞杆苏云金芽胞蕈状芽胞杆炭疽芽胞杆
菌
+
菌
+
杆菌
+
菌
+
菌
+
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动力
硝酸盐还原
酪蛋白分解
卵黄反应
葡萄糖利用
（厌氧）
甘露醇
木糖
溶血
大多数阴性。
+-
-
+-
-
-
+
+-
-
+-
+
+
+
+
-
-
+
+-
+
+-
+
+
-
-
+
-
+
+-
+
+
-
-
-+
-
+
+-
+
+
-
-
-+
注：+90%~1 00%的菌株阳性；-90%~100%的菌株阴性；+-大多数阳性；-+
本菌在生化性状上与苏云金 芽胞杆菌极为相似，但后者可籍细胞内产生蛋白质
毒素结晶加以鉴别。其检验方法如下：取营养琼脂上纯 培养物少许，加少量蒸
馏水涂于玻片上，待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上，半分钟后倾去甲醇，置火焰上干燥，然后滴加0.5%碱性复红液，并用酒精灯加热至微见蒸
气维持1.5分钟 ，移去酒精灯，将玻片放置半分钟，倾去染液，置洁净自来水充
分漂洗、晾干、镜检。在油浸镜下检查有 无游离芽胞和深染的菱形的红色结晶
小体（如未形成游离芽胞，培养物应放室温再保存1~2天后检查） ，如有即为苏
云金芽胞杆菌，蜡样芽胞杆菌检查为阴性。
（二）沙门氏菌（依据国标GBT 4789.4-2003）

1 培养基和试剂
1.1 缓冲蛋白胨水(BP)：按GB 4789.28中4.12规定。

蛋白胨10g 氯化钠5g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 9g 磷酸二氢
钾1.5g 蒸馏水1000mL pH7.2

按上述成分配好后以大烧瓶装，121℃高压灭菌15min。临用时无菌分装
每瓶225mL。
1.2 氯化镁孔雀绿(MM)增菌液：按GB 4789.28中4.13规定。
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胰蛋白胨5g 氯化钠8g 磷酸二氢钾1.6g 蒸馏水1000mL

氯化镁(化学纯) 40g 蒸馏水100mL

0.4%孔雀绿水溶液。

分别按上述成分配好后，121℃高压灭菌15min备用。临用时取甲液90mL、< br>乙液9mL、丙液0.9mL，以无菌操作混合即可。
1.3 四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液：按GBT 4789.28中4.14、4.15规定。
1.3.1 基础培养基
多胨或胨 5g 胆盐1g 碳酸钙10g 硫代硫酸钠 30g 蒸馏水1000mL
1.3.2 碘溶液
碘 6g 碘化钾5g 蒸馏水 20mL
1.3.3 制法
将基础培养基的各成分加入蒸馏水中， 加热溶解，分装每瓶100mL。分装
时应随时振摇，使其中的碳酸钙混匀。121 ℃高压灭菌15m in备用。临用时每
100mL基础培养基中加入碘溶液2mL、0.1%煌绿溶液1mL。
1.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：按GBT 4789.28中4.16规定。
1.4.1 成分
蛋白胨 5g 乳糖 4g 亚硒酸氢钠4g 磷酸氢二钠 5.5g 磷酸二氢钾 4.5g L-
胱氨酸 0.01g 蒸馏水1000mL
L-胱氨酸-氢氧化钠溶液的配法：
称取L-胱氨酸0.1g（或DL- 胱氨酸0.2g），加1molL 氢氧化钠1.5mL，
使溶解，再加入蒸馏水8.5mL即成。
1.4.3 制法
将除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸 馏水中，加热煮
沸，俟冷备用。另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中，加热煮沸，俟冷，以
无菌操作与上液混合。再加入1% L-胱氨酸-氢氧化钠溶液1mL。分装于灭菌瓶
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中，每瓶100mL，pH应为7.0±0.1。
1.5 亚硫酸铋琼脂(BS)：按GBT 4789.28中4.19规定。
1.5.1 成分
蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 葡萄糖 5g 硫酸亚铁 0.3g 磷酸氢二钠 4g
煌绿 0.025g 柠檬酸铋铵 2g 亚硫酸钠 6g 琼脂 18～20g 蒸馏 1000mL
pH7.5

将前面5种成分溶解于300mL蒸馏水中。
将柠檬酸铋氨和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水溶解。
将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，冷至80℃。
将以上三液合并，补充蒸馏水至1000mL，校正pH，加0.5%煌绿水溶
液5mL，摇匀。冷至50～55 oC，倾注平皿。
注：此培养基不需高压灭菌。制备过 程不宜过分加热，以免降低其选择性。应
在临用前一天制备，贮存于室温暗处。超过48h不宜使用。
1.6 DHL琼脂：按GBT 4789.28中4.20规定。
1.6.1 成分
蛋白胨 20g 牛肉膏 3g 乳糖 10g 蔗糖 10g 去氧胆酸钠 1g 硫代硫酸
钠 2.3g 柠檬酸钠1g 柠檬酸铁铵 1g 中性红 0.03g 琼脂 18～20g 蒸
馏水 1000mL pH7.3
1.6.2 制法
将除中性红和琼脂以外的成分溶解于400ml蒸馏水中，校正pH。再将琼
脂于60 0ml蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，并加入0.5%中性红水溶液6ml，
待冷至50～55 ℃，倾注平板。
1.7 HE琼脂：按GBT 4789.28中4.21规定。

胨12g 牛肉膏3g 乳糖12g 蔗糖12g 水杨素2g 胆盐20g 氯化纳
5g 琼脂 18～20g 蒸馏水 1000mL 0.4% 溴麝香草酚蓝 16mL Andrade
指示剂 20mL 甲液20mL 乙液20mL pH7.5

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将前面七 种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于
600mL蒸馏水内，加热溶解。加入甲液 和乙液于基础液内，校正pH。再加入
指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50～55℃，倾注平板。
注：①此培养基不可高压灭菌
②甲液的配制：硫代硫酸钠34g 柠檬酸铁铵4g 蒸馏水100mL
③乙液的配制：去氧胆酸钠10g 蒸馏水 100mL
④Andrade指示剂：酸性复红0.5g 1molL氢氧化钠溶液16mL 蒸馏
水 100mL 将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色
不全，再加氢氧化钠溶液1～2mL。
1.8 WS琼脂：按GBT 4789.28中4.23规定。

胨 12g 牛肉膏 3g 氯化纳 5g 乳糖 12g 蔗糖 12g 十二烷基硫酸钠 2g
琼脂 15g Andrade指示剂 20mL 0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16mL 甲液 20mL
蒸馏水 1000mL pH7.0
1.8.2 制法
除指示剂和甲液外，将其它成分加热溶解，不许消毒，校正pH后加入指示
剂 和甲液，倾注平板应呈草绿色。
注：①供沙门氏菌分离用
②Andrade指示剂和甲液的配制均见HE琼脂。
1.9 SS琼脂：按GBT 4789.28中4.22规定。
1.9.1 基础培养基
牛肉膏 5g 胨 5g 三号胆盐 3.5g 琼脂 17g 蒸馏水 1000mL
将牛 肉膏、胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入于600mL蒸馏
水中，煮沸使其溶解，再将两 液混合，121 ℃高压灭菌15min，保存备用。

基础培养基 1000mL 乳糖 10g 柠檬酸钠 8.5g 硫代硫酸钠 8.5g
10%柠檬酸铁溶液 10mL 1%中性红溶液 2.5mL 0.1%煌绿溶液 0.33mL
加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均匀，校
正至pH7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。
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注：①制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用。
②煌绿溶液配好后应在10d以内使用。
③可以购用SS琼脂的干燥培养基。
1.10 三糖铁琼脂：按GBT 4789.28中4.26，4.27规定。
1.10.1 成分
蛋白胨 20g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1g 氯化纳 5g
硫酸亚铁铵[Fe（NH4）2（SO4）2?6H2O] 0.2g 硫代硫酸钠 0.2g 琼脂 12g
酚红 0.025g 蒸馏水 1000mL pH7.4

将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热
煮沸，以溶 化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5ml，摇匀。分装试管，装量宜
多些，以便得到较高的底层。 121 ℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。
1.11 蛋白胨水、靛基质试剂：按GBT 4789.28中3.13规定。

蛋白胨（或胰蛋白胨）20g 氯化纳 5g 蒸馏水 1000mL pH7.4

按上述成分配制，分装小试管，121 ℃高压灭菌15min。
1.11.3 靛基质试剂
柯凡克试剂：将5g对二甲氨苯甲醛溶解于75ml戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸
25ml。
欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入
浓盐酸20mL。

挑取小量培养物接种，在36±1 ℃培养1～2d，必要时可培养4～5d。 加
入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧- 波试
剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红
色。
注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定
后方可使用。
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1.12 尿素琼脂(pH7.2)：按GBT 4789.28中3.15规定。
1.12.1 成分
蛋白胨 1g 氯化纳 5g 葡萄糖 1g 磷酸二氢钾 2g 0.4%酚红溶液 3mL
琼脂 20g 蒸馏水 1000mL 20%尿素溶液 100mL pH7.2±0.1

将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH，加入琼 脂，加热溶化并分装
烧瓶。121℃高压灭菌15min。冷至50～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶 液。
尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2±0.1。分装于灭菌试验内，放成斜面
备用 。

挑取琼脂培养物接种，在36±1 ℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由
于产碱而使培养基变为红色。
1.13 氰化钾(KCN)培养基：按GBT 4789.28中3.16规定。

蛋白胨 10g 氯化纳 5g 磷酸二氢钾 0.225g 磷酸氢二钠 5.64g 蒸馏
水 1000mL 0.5%氰化钾溶液 20mLpH7.6

将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121 ℃高温灭菌15min。放在冰
箱内使其充分冷却。每 100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为
1:10000),分装于12mm ×100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞
塞紧，放在4 ℃冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作
为对照培养基，分装试管备用。

将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾
（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36±1 ℃培养1～2d，
观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制）。
注：氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养
基应在冰箱内进行 。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生
氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生 长，因而造成假阳性反应。试验
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时对每一环节都要特别注意。
1.14 氨基酸脱羧酶试验培养基：按GBT 4789.28中3.12规定。

蛋白胨 5g 酵母浸膏 3g 葡萄糖 1g 蒸馏水 1000mL 1.6% 溴甲酚紫-
乙醇溶液1mL L-氨基酸或DL-氨基酸 0.5或1g100mL PH6.8

除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：
赖 氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入。DL-氨基酸按1%加入。
再行校正pH至6.8 。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管
0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115 ℃高温灭菌10min。

从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36±1℃培养 18～24h,观察结果。氨基
酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡 萄糖
产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
1.15 糖发酵管：按GBT 4789.28中3.2规定。
蛋白胨10g 氯化钠3g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2g 0.2%滇麝
香草酚蓝溶液12mL 蒸馏水1000mL pH7.4

（1）葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加 入葡萄糖，分装于有一个倒
置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。
（2）其他各 种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭
菌15min。另将各种糖类分 别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液
加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管 。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
，于36±1℃培养，一般观察2～3d。迟缓反应需观察14～30d。
1.16 ONPG培养基：按GBT 4789.28中3.3规定。
1.16.1 成分
邻硝基酚β-D-半乳糖苷（ONPG）60mg 0.01molL磷酸钠缓冲液（pH7.5）
10mL 1%蛋白胨水（pH7.5）30mL
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将ONPG溶于缓冲液内，加以蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×
75mm试管，每管0.5 ml，用橡皮塞赛紧。
1.16.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于36±1℃培养1～3h和24h观察
结果。如果β- 半乳糖苷酶产生，则于1～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。
1.17 半固体琼脂：按GBT 4789.28中4.30规定。

蛋白胨 1g 牛肉膏 0.3g 氯化钠 0.5g 琼脂 0.35～0.4g 蒸馏
水 100mL pH7.4

按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分装小试管。121 ℃高温灭菌
15min。直立凝固备用。
注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用.
1.18 丙二酸钠培养基：按GBT 4789.28中3.7规定。

酵母浸膏 1g 硫酸铵 2g 磷酸二氢钾 0.6g 磷酸二氢钾0.4g 氯化纳 2g
丙二酸钠 3g 0.2% 溴麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL pH6.8

先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121 ℃
高温灭菌15min。

用新鲜的琼脂培养物接种，于36±1 ℃培养48h，观察结果。阳性者由绿色
变为蓝色。
1.19 沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163
种用于详细分型。
2 操作步骤
2.1 前增菌和增菌
冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经 过前增菌。以无菌操作取检样25g
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（mL），加 在装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应
用均质器以8000～1000 0rmin打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食
品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36±1℃ 培养4h(干蛋品培养18～24h)，移
取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸 钠煌绿增菌液内，于
42℃培养18～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸 增菌
液内，于36±1℃培养18～24h。
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不 必经过前增菌。各取25g(25mL)
加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL ，接种于100mL氯
化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25m L
接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36±1℃培养18～24h。
2.2 分离
取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或
HE琼 脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板
上。于36±1℃分别培养1 8～24h(DHL、HE、WS、SS)或40～48h(BS)，观察
各个平板上生长的菌落，沙门 氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平
板上的菌落特征见表1。
表1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平
板
亚硫酸铋琼脂 产硫化氢菌落为黑色有金属黑色有金属光泽
光泽、棕褐色或灰色，菌落周
围培养基可呈黑色或 棕色；有
些菌株不产生硫化氢，形成灰
绿色的菌落，周围培养基不变
DHL琼脂
无色半透明，产硫化氢菌落中乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与
心带黑色或几乎全黑色 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ
相同；乳糖阳性的菌株为粉红
色，中心带黑色
HE琼脂
蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫乳糖迟缓阳性的菌株为黄色，
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沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）
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WS琼脂
化氢，菌落中心黑色或几乎全中心黑色或几乎全黑色；乳糖
黑色 迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿
色或蓝色，中心黑色或几乎全
黑色
SS琼脂
无色半透明，产硫化氢菌株有乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与
的菌落中心带黑色，但不如以沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ 、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ
上培养基明显 相同；乳糖阳性的菌株为粉红
色，中心黑色，但中心无黑色
形成时与大肠艾希氏菌不能区
别
2.3 生化试验
2.3.1 自选择性琼脂平 板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在
三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表 2。
表2 肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果
斜面
-
+
-
-
底层 产气 硫化氢
+
+
+
+
+-
+-
+
-
+
+
-
-
可能的菌属和种
沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、
缓慢爱德华氏菌
沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆
菌
沙门氏菌属、大肠艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、
摩根氏菌、普罗菲登斯菌属
伤寒沙门 氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠
艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲
登斯菌属
+ + +- - 大肠艾希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷
氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、
注：+阳性；-阴性；+-多数阳性，少数阴性。

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表2说明在三糖铁 琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H
2
S)阴性的菌株可以
排除，其他的反应结果均 有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。
2.3.2 在接种三糖铁琼脂的同时，再接种 蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂
(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验 培养基及对照培养基各1管，
于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果 。按反应序
号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排
除 。
表3 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表
反应硫化氢靛基
PH7.
2尿
素
-
-
+
+
-
-
-
-
+-
+
+-
氰化钾
（KCN
）
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
赖氨
酸脱
羧酶
+
+
-
-
+
-
+
-
+
-
-
沙门氏菌属
沙门氏菌属（少见）缓慢爱德
氏菌
弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变
形杆菌属
普通变形杆菌
沙门氏菌属、大肠艾希氏菌、
甲型副伤寒沙门氏菌、大肠艾
希氏菌、志贺氏菌属
大肠艾希氏菌、大肠艾希氏菌、
志贺氏菌属
克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆
菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、
摩根氏摩根氏菌、普罗菲登斯
菌
判定菌属
序号 （H
2
S） 质
A1
A2
A3
A4
B1
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
B2
B3
B4
注1：三糖铁琼脂底层均产酸；不产酸者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。
注2：KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。
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注3：+阳性；-阴性；+-多数阳性，少数阴性。

反应序号A1：典型反应判 定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中
有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常 ，则按A3判定为弗劳
地氏柠檬酸杆菌。
表4
PH7.2尿氰化钾（KCN） 赖氨酸
素
-
-
+
-
+
-
-
+
+
甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结
果）
沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特
性）
沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结
果）
判定结果
注：+阳性；-阴性。
反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。
表5
甘露醇 山梨醇
+
-

反应序号B1： 补做ONPG。ONPG十为大肠埃希氏菌，ONPG－为沙门氏菌。
同时，沙门氏菌应为赖氨酸＋，但 甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸－。
必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表6 沙门氏菌属各生化群的鉴别
项目
卫矛醇
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
判定结果
沙门氏菌靛基质阳性变体（要求血清学鉴定结果）
缓慢爱德华氏菌
+
-
注：+阳性；-阴性。
+ + - - + -
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山梨醇
水杨苷
ONPG
丙二酸盐
氰化钾
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注：+阳性；-阴性。
2.4 血清学分型鉴定（略）：祥见GBT4789.4-2003中6.4部分。
（三）金黄色葡萄球菌（依据国标GBT4789.10-2003）
1 培养基和试剂
1.1 胰酪胨大豆肉汤：按GBT 4789.28中4.59规定。
胰酪胨(或胰蛋白胨)17g, 植物蛋白胨(或大豆蛋白胨)3g,氯化钠100g,磷酸
氢二钾2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸馏水1000ml.
将上述成分混合,加热并轻轻搅拌并溶解,分装后,121℃高压灭菌15 min,最
终PH7.3±0.2.
1.2 7.5%氯化钠肉汤：按GBT 4789.28中4.61规定。

蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠75g,蒸馏水1000mL,pH7.4

将上述成分加热溶解，校正pH，分装试管，121℃高压灭菌15min。
1.3 血琼脂平板：按GBT 4789.28中4.6规定。

豆粉琼脂(PH7.4~7.6)100 mL,脱纤维羊血(或兔血)5~10mL

加热溶化琼脂，冷却50℃,以灭菌手续加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板.亦可
分装灭菌试管,置成斜 面.亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼.
1.4 Baird－Prker琼脂平板：按GB 4789.28中4.60规定。
1.4.1 成分：
胰蛋白胨10 g、牛肉膏5g、酵母膏1g、丙酮酸钠10g、甘氨酸12g、氯
化锂(LiCl·6H2O) 5g、 琼脂20g，蒸馏水950mL


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1.4.2 增菌剂的配法：
30%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于
冰箱内；
1.4.3 制法：
将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷至25℃，校正pH。分
装每瓶95mL， 121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每
95mL加入预热至50℃的卵黄 亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板。培养基
应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h 。
1.5 肉浸液肉汤：按GBT 4789.28中4.1规定。
1.5 肉浸液肉汤：
1.5.1 成分：
绞碎牛肉500g、氯化钠5g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾2g、蒸馏水1000mL。
1.5.2 制法：
将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水1000mL，混合后放冰 箱过夜，
除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤
压收集全 部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、氯化钠和磷酸盐，溶解后校正
pH7.4～7.6煮沸并过滤，分 装烧瓶， 121℃高压灭菌30min。

1.6 灭菌盐水。
1.7 兔血浆：按GBT 4789.28中4.63规定。
取3.8%柠檬酸钠溶液一份加兔(或人)全血 四份，混好静置之，则血球下降，
即可得血浆进行试验。
2 操作步骤
2.1 增菌培养法
2.1.1 检样处理
无菌操作取检样25g（mL），加入225mL 灭菌生理盐水，固体样品研磨或
置均质器中制成混悬液。
2.1.2 增菌及分离培养
吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL
培养基内， 置36±1℃温箱培养24h，转种血平板和Baird－Parker平板，36±
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1℃培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试
验。
2.1.3 形态
本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡 萄
球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。
2.1.4 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大 豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈
混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形 、不透明、
表面光滑，周围有溶血圈。在Baird－Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、< br>直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外
层有一透明圈。用 接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶
解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保 存的冷冻或干燥食品中所分离的
菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
2.1.5 血浆凝固酶试验
吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入 培养24h的金黄色
葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每 半
小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，
被认为阳性结 果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
2.2 直接计数方法
2.2.1 吸取上述1：10混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择
不同浓度的稀释液1mL，分别 加入三块Baird－Parker平板，每个平板接种量
分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL ，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸
收，可将平板放在36±1℃温箱1h，等水分蒸发后反 转平皿置36±1℃温箱培
养。
2.2.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并 从中任选5个菌落，分
别接种血平板，36±1℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同 增
菌培养法。
2.2.3 菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘 以血
浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球
菌数。
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补充：血浆凝固酶试验 ：取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于
8mm×100mm试管内充分混合,置 36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至
少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。试验中需
同时做巳知阳性和阴性
九、涂抹检验：同冰淇淋微生物检验方法，见124页。
十、空气净度检验：同冰淇淋微生物检验方法，见125页。
十一、水样检测：同冰淇淋微生物检验方法，见126页。
十二、无菌奶的检验：
检样前处理：用消毒剪刀将利乐包（枕）的一端剪开，开口处朝酒精灯火焰一
方。
（一）菌落总数测定

用1ml灭菌吸管吸取1ml无菌奶于灭菌平皿内，做两个平皿 ，其他步骤同
于冰淇淋产品的菌落总数检验。
（二）大肠菌群的测定
1.初发酵：
用10ml灭菌吸管吸取10ml无菌奶沾管壁缓缓注入双料乳糖胆盐发酵管内，用
1ml灭菌 吸管吸取1ml无菌奶，沾管壁缓缓注入单料乳糖胆盐发酵管内，用1ml
灭菌吸管吸取1ml无菌奶， 注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，
振摇试管混匀，做成1：10的稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1：10的稀释液，沾管壁缓缓注入单料乳糖胆盐发酵管内，
将接种的 9管置36±1℃温箱内培养24±2h，如果乳糖胆盐发酵管都不产
气，则可报告为大肠菌群阴性，如 有产气者，则按下列程序进行。
2.分离培养：同于冰淇淋微生物检验方法，见111页。
3.证实试验：同于冰淇淋微生物检验方法，见111页。
十三、半成品的检验：
（一）菌落总数测定
注：选10
-2
10
-3
两个稀释度进行检验。
(二)芽孢、耐热芽孢的检测：
注：选原液进行检验。
十四、乳制品中乳酸菌益生菌的测定方法

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（一）培养基及培养方法：
菌 名
嗜热链球菌
乳酸杆菌总数
嗜酸乳杆菌
干酪乳杆菌
双歧杆菌
培养基及培养方法
培养基
M17 琼脂
MRS 琼脂 ，强化盐酸半胱
氨酸至0.05%
MRS琼脂+氯洁霉素
MRS琼脂，pH5.4
RCM 琼脂 + NNLT (抗生
素溶液)
培养方法
M17 琼脂37°C培养72小时
MRS 琼脂用pH5.4 的乙酸酸
化
厌氧培养 37°C培养72小时
厌氧培养: 37°C培养72小时
MRS 琼脂用pH5.4的乙酸酸化
厌氧培养: 25°C培养72小时
厌氧培养: 37°C培养72小时
（二）培养基准备：
1 稀释剂：
1.1 用无菌的胰化胨溶液稀释细菌的菌落计数( 除了双歧杆菌) 。
1.2 双歧杆菌的菌落计数必需用无菌的胰化胨和盐酸半胱氨酸溶液稀释 。
2 培养基 :
2.1 M17 琼脂：用商品M17 培养基，按说明配制溶液。
2.2 MRS琼脂：用商品MRS培养基，按说明配制溶液。灭菌后用乙酸调节PH 到
5.4 。
2.3 RCM琼脂：用商品RCM培养基，按说明配制溶液。灭菌后在使用之前，在
RCM培 养基中加入NNLT 溶液。
3 胰化胨溶液:
3.1 组成：胰蛋白胨1 g，NaCl (氯化钠) 8.5 g，蒸馏水1000 ml
3.2 制法：溶液分瓶装。数量小于100 毫升的，用灭菌锅121?C 灭菌15 分钟，
数量大于100 毫升的， 121?C 灭菌20 分钟。
3.3 保藏: 4°C 下保藏一个月。
4 胰化胨溶液 + 盐酸半胱氨酸 :
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4.1 组成 ：胰蛋白胨1 g，NaCl (氯化钠) 8.5 g，蒸馏水1000 ml，盐酸半胱氨
酸0.5 g
4.2 制法：溶液分瓶装。数量小于100 毫升的，用灭菌锅121?C 灭菌15 分钟，
数量大于100 毫升的，121?C 灭菌20 分钟。
4.3 保藏: 4°C 下保藏一个月。
5 RCM + NNL T
5.1 RCM Agar 琼脂( 强化梭状芽孢杆菌琼脂 ). 灭菌锅121?C 灭菌15分钟。
5.2 NNLT 溶液 :
5.2.1 组成：新霉素硫酸盐0. 1 g，奈啶酮酸0.015 g，氯化锂3.0 g，TTC 0.025 g，
蒸馏水50 ml
5.2.2 制法：溶液用避光瓶装。过滤灭菌(0.45μm 过滤器)。
5.2.3 保藏： 4?C下保藏一个月。
5.2.4 准备：在使用之前，5%的NNLT溶液在无菌条件下加 入RCM琼脂中，并
按1%比例加入5%盐酸半胱氨酸溶液。
6 MRS + 氯洁霉素溶液
6.1 氯洁霉素溶液 :
6.1.1 组成 :氯洁霉素0.01g，蒸馏水200ml，
6.1.2 制法：溶液分瓶装。过滤灭菌(0.45μm 过滤器)。
6.1.3 保藏： 4?C下保藏一个月。
6.2 MRS + 氯洁霉素 (选择性的培养基) :
6.2.1 准备：在使用之前，0.2%的氯洁霉素溶液在无菌条件下加入MRS琼脂中。
十五、志贺氏菌的检验
（一）培养基和试剂
1、GN增菌液：依据GBT 4789.28-2003中4.17
1.1成分
胰蛋白胨20g，葡萄糖1g，甘露醇2 g，柠檬酸钠5g，去氧胆酸钠0.5g，
磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水 1000ml，PH7.0。
1.2制法
按上述成份配好，加热使溶解，校正PH 。分装每瓶225ml，115℃高压灭
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菌15min。
2、HE琼脂：依据GBT 4789.28-2003中4.21
2.1成分
胨 12g，牛肉膏3g，乳糖 12g，蔗糖 12g，水杨素2g，胆盐20 g，氯
化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml，甲液 20ml，乙液20ml，PH7.5。
2.2制法
将前面七种成份溶解于400ml蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于600ml
蒸馏 水内，加热溶解。加入甲液和乙液于基础液内，校正PH。再加入指示剂，
并与琼脂液合并，待冷至50 ~55℃，倾注平板。
注1：此培养基不可高压灭菌。
注2：甲液的配制
硫代硫酸钠34g，柠檬酸铁铵4g，蒸馏水 100ml。
注3：乙液的配制
去氧胆酸钠10g，蒸馏水100ml。
注4：Andrade指示剂
酸性复红0.5g，1molL氢氧化钠溶液16ml，蒸馏水100ml。
3、SS琼脂：依据GBT 4789.28-2003中4.22
3.1基础培养基
牛肉膏5g，胨 5g，三号胆盐 3.5g，琼脂17g，蒸馏水1000ml。
将牛肉膏 、胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入于600ml蒸馏水
中，煮沸使其溶解，再将两液， 121℃高压灭菌15min，保存备用。
3.2完全培养基
基础培养基1000ml，乳 糖10g，柠檬酸钠8.5g，硫代硫酸钠8.5g，10%
柠檬酸铁溶液10ml，1%中性红溶液2 .5ml，0.1%煌绿溶液0.33ml。
加热溶化基础培养基，按比例加入上述除染料以外的各成 份，充分混合均
匀，校正至PH7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。
注1：制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用。
注2：煌绿溶液配好后应在10d以内使用。
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注3：可以购用SS琼脂的干燥培养基。
4、麦康凯琼脂：依据GBT 4789.28-2003中4.24
4.1成份
蛋白胨17g，胨3g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，氯化钠 5g，琼脂 17g，
蒸馏水1000ml，乳糖 10g，0.01%结晶紫水溶液10ml，0.5%中性红水溶液
5ml。
4.2制法 < br>，校正PH7.2。将琼脂加入600ml蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于
烧瓶内，1 21℃高压灭菌15min备用。
，趁热加入乳糖，冷至50~55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注
平板。
注：结晶紫和中性红水溶液配好后须经高压灭菌。
5、伊红美蓝琼脂（EMB）：依据GBT 4789.28-2003中4.25
5.1成份
蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2％伊红水溶液20 ml，
0.65％美蓝水溶液13ml ，蒸馏水1000ml，pH为7.1。
5.2制法：
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内， 1 21℃
高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55℃，加入
伊 红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

6.1成分
蛋白胨20g,牛肉膏5g,乳糖10g,蔗糖10g,葡萄糖1g,氯化纳5g,
硫酸亚铁铵[Fe （NH4）2（SO4）2?6H2O]0.2g,硫代硫酸钠0.2g,琼脂12g,
酚红0.025g,蒸馏水1000mL,pH7.4
6.2制法
将 除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热
煮沸，以溶化琼脂。加入0.2 %酚红水溶液12.5ml，摇匀。分装试管，装量宜
多些，以便得到较高的底层。121 ℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。
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6、三糖铁琼脂（TSI）: 依据 GBT 4789.28-2003中4.26,4.27
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7、葡萄糖半固体管：依据GBT 4789.28-2003中4.31
7.1成分
蛋白胨 1g 牛肉膏 0.3g 氯化钠 0.5g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml
葡萄糖1g 琼脂 0.3g 蒸馏水 100mL pH7.4
7.2制法
将蛋白胨、牛肉膏和氯化钠加入于水中 ，并校正pH后加入琼脂加热溶解。
在加入指示剂和葡萄糖，分装小试管。121 ℃高温灭菌15min。
8、半固体管：依据GBT 4789.28-2003中4.30
8.1成分
蛋白胨 1g 牛肉膏 0.3g 氯化钠 0.5g 琼脂 0.35～0.4g 蒸馏
水 100mL pH7.4
8.2制法
按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分装小试管。121 ℃高温灭菌
15min。直立凝固备用。
注：供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用.
9、葡萄糖铵琼脂：依据GBT 4789.28-2003中3.8
9.1成份
氯化钠5g，硫酸镁（MgSO4·7H2 O）0.2g，磷酸二氢铵1g，磷酸氢二钾
1g，葡萄糖2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，0 .2%溴麝香草酚蓝溶液40ml，
PH6.8。
9.2制法
先将盐类和 糖溶解于水内，校正PH，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示
剂，混合均匀后分装试管，121 ℃高温灭菌15min。放成斜面。
10、尿素琼脂（PH7.2）: 依据GBT 4789.28-2003中3.15
10.1 成分
蛋白胨 1g ，氯化纳 5g ， 葡萄糖 1g ，磷酸二氢钾 2g ，0.4%酚红溶
液 3mL ，
琼脂 20g， 蒸馏水 1000mL ，20%尿素溶液 100mL， pH7.2±0.1
10.2制法
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将除尿素和琼 脂以外的成分配好，并校正pH，加入琼脂，加热溶化并分装
烧瓶。121℃高压灭菌15min。冷至 50～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。
尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2±0.1。分 装于灭菌试验内，放成斜面
备用。
10.3试验方法
挑取琼脂培养物接种，在36±1 ℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于
产碱而使培养基变为红色。
11、西蒙氏柠檬酸盐琼脂：依据GBT 4789.28-2003中3.5
11.1成份
氯化钠5g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g，磷酸二氢铵1g，磷酸氢二钾
1g， 柠檬酸钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，0.2%溴麝香草酚蓝溶液40ml，
PH6.8。
11.2制法
先将盐类溶解于水内，校正PH，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，
混合均匀后分装试管，121 ℃高温灭菌15min。放成斜面。
12、氰化钾培养基：依据GBT 4789.28-2003中3.16
12.1成分
蛋白胨 10g， 氯化纳 5g， 磷酸二氢钾 0.225g ， 磷酸氢二钠 5.64g ，蒸
馏水 1000mL， 0.5%氰化钾溶液 20mL，pH7.6。
12.2制法
将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121 ℃高温灭菌15min。放在冰
箱内使其充分冷却。每 100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为
1:10000),分装于12mm ×100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞
塞紧，放在4 ℃冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作
为对照培养基，分装试管备用。
12.3试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于 氰化钾
（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36±1 ℃培养1～2d，
观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制）。
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注：氰化钾是剧 毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培
养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是 封口不严，氰化钾逐渐分解，产
生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应 。试
验时对每一环节都要特别注意。
13、氨基酸脱羧酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基，依据GBT
4789.28-2003中3.12
13.1成分
蛋白胨 5g ，酵母浸膏 3g ，葡萄糖 1g， 蒸馏水 1000mL ， 1.6% 溴
甲酚紫-乙醇溶液1mL ， L-氨基酸或DL-氨基酸 0.5或
1g100mL ， PH6.8。
13.2制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：
赖 氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入。DL-氨基酸按1%加入。
再行校正pH至6.8 。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管
0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115 ℃高温灭菌10min。
13.3试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36±1℃培养18～24h,观察结果。氨基
酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱 性产物，但因葡萄糖
产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。
14、糖发酵管：棉子糖、甘露醇、甘油、七叶苷及水杨苷。依据GBT
4789.28-2003中3.2
14.1成分：
牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2g，
0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL，蒸馏水1000mL，pH7.4
14.2制法：
，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌
15min。
，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，
同 时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试
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管。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
14.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量 培养物接种，于36±1℃培养，一般观
察2～3d。迟缓反应需观察14～30d。
15、5%乳糖发酵管：依据GBT 4789.28-2003中4.32
15.1成分：
蛋白胨0.2g，氯化钠0.5g，乳糖5 g，2%溴麝香草酚蓝水溶液1.2ml，蒸
溜水100 ml， PH 7.4。
15.2制法：
除乳糖以外的各成份溶解于50ml蒸馏水中，校正PH。将乳糖溶解于另外
50ml蒸馏水内，分别灭菌121℃15min。将两液混合，以无菌操作分装于灭菌
小试管 内。
16、蛋白胨水、靛基质试剂：依据GBT 4789.28-2003中3.13
16.1成分
蛋白胨（或胰蛋白胨）20g， 氯化纳 5g ，蒸馏水 1000mL， pH7.4 。
16.2制法
按上述成分配制，分装小试管，121 ℃高压灭菌15min。
16.3 靛基质试剂
柯凡克试剂：将5g对二甲氨苯甲醛溶解于75ml戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸
25ml。
欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入
浓盐酸20mL。
16.4试验方法
挑取小量培养物接种，在36±1 ℃培养1～2d，必要时可 培养4～5d。加
入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧- 波试
剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红
色。
注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴
定后方可使用。
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17、志贺氏菌属诊断血清。
（二）操作步骤
1、增菌
以无菌操作取检 样25克（毫升），加入装有225毫升GN增菌液的广口瓶内，固
体食品用均质器以8000rmin ~10000rmin打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状
食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化 ，于36℃培养6h~8h。培养时间视细菌生长情况
而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
2、分离和初步生化试验
（1）取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个 ；另取一环
划线接种于麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂平板一个，于36℃培养18h~24h，志
贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
（2）挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼 脂和葡萄糖半固体各一管。一般应
多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18h~24h，分别观察结 果。
（3）下述培养物可以弃去：
a）在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b）在18h~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c）不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d）产气的培养物；
e）有动力的培养物；
f）产生硫化氢的培养物。
（4）凡是乳糖、蔗糖不发酵， 葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少
量气体），无动力的菌株，可以做血清学分型和进一步的 生化试验。
3、血清学分型和进一步的生化试验
（1）血清学分型
挑取三糖 铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血
清检查，如果由于k抗原的存在而不出现 凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果
出呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系 B群福氏志
贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗
原见表 一。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次
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选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，
并进一步用1~ 15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志
贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血 清检查。
表1 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原
型和亚型
1a
1b
2a
2b
3a
3b
4a
4b
5a
5b
6
X变体
Y变体
型抗原
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅴ
Ⅵ
-
-
群抗原
1,2,4,5,9…..
1,2,4,5,9…..
1,3,4……
1,7,8,9…..
1,6,7,8,9….
1,3,4,6….
1,(3,4)….
1,3,4,6….
1,3,4
1,5,7,9….
1,2,(4)….
1,7,8,9…
1,3,4….
在群因子血清中的凝集
3,4 6 7,8
+ - -
+ + -
+ - -
- - +
- + +
+ + -
(+) - -
+ + -
+ - -
- - +
(+) - -
- - +
+ - -
注:+凝集;-不凝集;( )有或无.
（2）进一步的生化试验
在做血清学分型的同时,应做进一步的生化试验,即:葡萄糖铵 ,西蒙氏柠檬酸
盐,赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶,PH7.2尿素，氰化钾生长，以及水杨苷和七叶苷的分< br>解。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结
果。必要时还应做 革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴
性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某 种志贺氏菌分型血清发生凝集，
仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
已判定为志贺氏菌属的培 养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖
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和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的
生化特性。但福氏6型的生 化特性与A群或C群相似，见表2。
表2 志贺氏菌属四个群的生化特性
生 化 群
A群：痢疾志贺氏菌
B群：福氏志贺氏菌
C群：鲍氏志贺氏菌
D群：宋内氏志贺氏菌
4、结果报告
综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
十六、 微生物鉴定（依据国标GBT 4789.26-2003）
（一）平板划线法：
1.先倒好琼脂平板两个，锰盐琼脂平板两个，待其凝固；
2.用酒精棉球将坏包开口处消毒 ，在无菌条件下用无菌吸管吸取1ml牛乳
注入平皿中，且做两个平皿。倒入琼脂（45
。C）培养基，待凝固，倒置于
36±1℃培养箱中培养细菌中数，24h后记数。（建议PH≤4时 做伊红美兰
平板划线，改良MC平板划线。）
3.接种环灭菌后，沾取少量坏包样液，在上述 倒好平板上划线，共划两个，
分别做芽孢，中温性细菌培养，耐热芽孢，高温性细菌培养。
4.然后观察坏包的组织状态、气味；
5.检测PH值；
6.分析报告结果。操作步骤：
芽 孢 中温性细菌培养
锰盐琼脂平板 普通琼脂平板
37
。
C、24h培养
涂片镜检
报 告
耐热芽孢 高温性细菌培养
锰盐琼脂平板 普通琼脂平板
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5%乳糖 甘露醇
-
-
-
+(+)
-
+
+
+
棉子糖
-
+
-
+
甘油
(+)
-
(+)
d
靛基质
-+
(+)
-+
-
注:+阳性;-阴性; -+多数阴性,少数阳性; (+)迟缓阳性; d有不同生化型。
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55
。
C、24h培养
涂片镜检
报告
（二）溴甲酚紫葡萄糖肉汤法

样品（3-5ml） 闻味，品尝
溴甲酚紫葡萄糖肉汤
需氧2支36±1
。
C 96--120h 需氧2支55±1C 24--72h

产酸产气 无菌落生长 无菌落生长 产酸产气
阳性 阴性 按无菌报告 阴性 阳性
划平板（细菌、锰盐平板各一个） 划平板（细菌、锰盐平板各一个）
36±1
。
C 96--120h
培养 涂片镜检 55±1C 24--72h培养
报 告

（三）疱肉培养法（厌氧）

样品（3-5ml） 闻味，品尝
疱肉培养基
厌氧2支36±1
。
C 96--120h 厌氧2支55±1C 24--72h

产酸产气 无菌落生长 无菌落生长 产酸产气
阳性 阴性 按无菌报告 阴性 阳性
划平板（细菌、锰盐平板各一个） 划平板（细菌、锰盐平板各一个）
36±1
。
C 96--120h培养 涂片镜检 55±1C 24--72h培养
报 告
疱肉培养基的配制方法：(依据国标GBT 4789.28-2003)
牛肉浸液[（500 g +1000 ml H
2
O）或蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠
5g，加入1000 ml蒸馏水中PH=7.6] 1000 ml
蛋白胨 30 g 酵母膏 5 g 磷酸二氢钠5 g
葡萄糖 3 g 可溶性淀粉2 g 碎肉渣 适量 PH=7.8
分装试管（15×150cm）：碎肉渣2-3 cm，混合液高出其约1 cm，上盖溶
化的凡士林或液体石蜡0.3-0.4 cm（2 ml）
121
。
C高压灭菌15min。
溴甲酚紫葡萄糖肉汤的配制方法：(依据国标GBT4789.26-2003)

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蛋白胨10 g，牛肉浸膏3 g，氯化钠5g，葡萄糖 10 g 溴甲酚紫0.04 g（或
1.6%酒精溶液2 ml） 蒸馏水1000 ml PH=7.0±0.2 1000 ml
调PH后加溴甲酚紫，分装每管10 ml ，121
。
C高压灭 菌10min。
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液体奶公司产品鉴定检验报告
产品名称

批号
检验项目
检验结果
感观 包 装
色 泽
滋 气 味
组 织 状 态
理化
微
生
物
PH
标 准 试 剂
细 菌 总 数
培 养 条 件
培 养 基
样品处理
细
菌
画
线
培养基
培养条件
菌落形态
结晶染色
革兰氏染色
H
2
O
2
酶试验
样品处理
芽
孢
画
线
培养基
培养条件
菌落形态
结晶染色
革兰氏染色
H
2
O
2
酶试验
耐
热
芽
孢
画
线
样品处理
培养基
培养条件
菌落形态
结晶染色
革兰氏染色
H
2
O
2
酶试验



























































































生产班次


生产日期


检验日期


判定日期

微生物初步结论
十七、小样发酵法的操作规程
（一）菌种的配制过程
1. 称取脱脂奶粉100克，加入700ml,蒸馏水，加热煮沸1 0分，冷却到
42±1℃
。
——复原乳
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2. 加入粉状菌种1.5克，与上述复原乳250ml中。——母复原乳。
3. 吸取20ml母复原乳加入250ml复原乳中，摇匀。
4. 于42±1℃水浴锅培养4小时，得到待用菌种。
5.菌种活力≥0.8时方可作为菌种备用。
（二）菌种活力的检测
1 镜检：
观察菌种比例及生长情况，要求：球菌数＞杆菌数。
2 活力检测及应用：
2.1 活力管制作：
用移液管取20mL无抗全脂奶粉还原奶12.5% ±0.2放入 18×180mm试管，
盖上试管帽，115℃，5分钟湿热灭菌（或间接煮沸，保持30min），冷 却到42-43℃
备用。（所用试管及移液管都应灭菌）
2.2 接种：
用1mL灭菌吸管吸取0.6mL--0.7mL发酵剂接入到42-43℃的活力管中，摇匀。
2.3 培养：
将活力管放入42-43℃恒温培养箱中培养3小时，取出测定酸度。
2.4 测定方法：
取出试管，将试管中的物质全部移入三角瓶中，加20ml蒸馏水，及1 0gL的
酚酞溶液2ml，然后用0.1molL的NaOH溶液进行滴定，记录消耗NaOH溶液的用量。
2.5 计算活力值：
活力值=NaOH用量（单位：毫升）×0.087（活力系数）
（三）发酵小样的操作过程
1.取原奶200ml于300mL三角瓶中，煮沸5分钟，冷却至42℃。
2.加入母菌种8ml于样品中，置与42±1℃水浴锅中培养2.5小时。
3.作感官判定、观察组织状态，后搅匀，取一部分立刻作黏度检测。
4.另称取样品5.0 000g于150mL三角瓶中，入40ml蒸馏水，滴加10gl酚酞5
滴。
5.用0.1molL NaOH滴定，呈粉红色30秒内不褪色。
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（四）计算
V×C
酸度 = ------------×1000
M
V——消耗0.1molL NaOH的量，ml；
C——NaOH溶液的准确浓度，molL；
M——称取样品的重量，g。
（五）标准
1.感官：
小样培养结束后，观察料液无乳清或轻微乳清析出，质地结实 ；将三
角瓶倾斜进行观察其状态，料液呈现规则的形状，象嫩豆腐状；无异味，呈
现正常发酵味 。否则判为不合格。
2.酸度：
小样培养2.5小时，开始测酸度，酸度达到45
0
T可使用；如果低于
45
0
T，测培养3小时的小样，酸度达到50
0
T以上可使用。
3.黏度：培养后立即检查时，≥1000CP（NDJ-8S型黏度计，2号转子、6#转速）
（六）方法说明
1、菌种制备必须用脱脂奶粉制做。
2、接粉状菌种时温度要求在42℃±1℃。
3、菌种在冰箱中冷藏贮存，并于96小时间内及时更换。
4、牛奶在接菌种时温度要求42℃±1℃。
第六部分 奶品微生物检验方法
一、菌落总数检测……………………………………………第178页
二、大肠菌群检测……………………………………………第178页
三、霉菌和酵母菌的检测……………………………………第178页
四、金黄色葡萄球菌检测……………………………………第178页
五、坂崎肠杆菌的检测………………………………………第178页
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六、涂抹检测…………………………………………………第180页
七、空净检测…………………………………………………第180页
八、水样检测…………………………………………………第180页
一、菌落总数检测：同于冰淇淋微生物检验方法，见116页。
二、大肠菌群检测：同于冰淇淋微生物检验方法，见109页。
三、霉菌和酵母菌的检测：同于液体奶微生物检验方法，见135页。
四、金黄色葡萄球菌检测：同于液体奶微生物检验方法，见155页。
五、坂崎肠杆菌(E. sakazakii)的检测:
1.材料和方法
1．1设备和材料
1．1．1 循环水浴箱45.5±0.2℃，管子浸没在水中，水面必须高于管子中培养基
的高度。(可用水浴锅使 样品充分溶解样品)。
1．1．2浸没型温度计0~50℃，0.1℃分刻度，约55cm长。
1．1．3孵育箱35~37℃ 和24~26℃。（可用培养箱）
1．1．4无菌吸管1ml、5ml、10ml，0.1ml分刻度。
1．1．5 2kg天平，灵敏度0.1g。
1．1．6接种针、3mm接种环、涂布玻璃棒。
1．1．7带放大镜的菌落计数器。
1．1．8 API20E生化试剂条。
1. 1. 9营养琼脂：蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠5.0g
琼脂15.0g 溶于蒸馏水中，加热溶解，121℃15分钟灭菌，至平板备用。
1．1． 10肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤）：必须用净化的牛胆粉和亮绿，以避免数量
极少的受损伤的肠杆菌不生 长。溶解所有的成分至1L蒸馏水，加热煮沸，分装成
90ml体积。这种培养基有商品化的干粉供应（ Oxoid,CM0317）,最终配制完的培
养基必须是绿色的。配制好的肉汤可在2±℃的环境中保 存4周。配方为：蛋白胨
10.0g 葡萄糖5.0g 磷酸氢二钠8.0g 磷酸二氢钾2.0g 牛胆粉20.0g 亮绿0.015g
1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液
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1%α-萘酚乙醇溶液
将配好后的1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液置于密塞棕色玻璃瓶中,于5～
10℃存放 。此试剂极易氧化,宜现用现配。试验时,取37℃18～24h的营养琼脂培养
物1支。将两种试剂各 2～3滴从斜面上端流下,2min内呈现蓝色者为细胞色素氧
化酶试验阳性,未发生变化者为阴性。
1.2方法
整个试验是基于“三管”增菌法，因此产品中数量极少的微生物可以被检测和定量 ，
整个试验至少需要333g样品。
1．2．1按“三管法”分别无菌称取100g, 10g, 1g,婴儿配方奶粉，依次加至2L,
250ml, 125ml大小的三角烧瓶中（10 0ml带螺帽的瓶子可代替10g和1g装样品
的烧瓶），分别加入9份无菌蒸馏水（1：10稀释比） ，预热至45℃，用手缓缓地
摇动至充分溶解。36℃孵育过夜,稀释度可根据情况调整。
1．2．2分别移取以上混合液10ml转种至装有90ml 无菌EE肉汤的稀释瓶中，
36℃孵育过夜。
1．2．3充分混合每个瓶子中的溶液，可采用以下A或B的方法进行分离培养：
A. 直接 涂布法：每一增菌培养物取0.2ml加到2个营养琼脂平板的表面，每个
营养琼脂平板各加0.1ml ，用无菌玻璃棒涂布（如果估计婴儿配方粉有很高的坂崎
肠杆菌数量，则增菌培养物须用无菌的EE肉汤 稀释至10
-4
~10
-6
后涂布。）
B. 直接划线法：每一增菌培养物用3mm的接种环（10μl）分别划2个营养琼
脂平板。
1 ．2．4将上述平板放置36℃过夜后，观察平板上的坂崎肠杆菌的典型菌落形态：
圆形较小呈黄色，表 面光滑的菌落。
1．2．5在营养琼脂琼脂平板上挑取黄色无光泽的菌落按API20E生化鉴定操作 说
明进行确证。阳性结果还须做氧化酶试验。
1．2．6根据每一稀释度出现的阳性确证结果 数来估计坂崎肠杆菌MPN值（同常
规MPN查表法）。
2.坂崎肠杆菌生化鉴定
革兰氏染色(24h) - 氧化酶(24h) -
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V-P实验 + 枸檬酸盐实验(柠檬酸盐) +
鼠李糖实验 +
溶血实验 不溶血
3.注意事项
1. 准确吸取培养物，培养时间不易过长。
2. 以上七项生化实验必须完全符合。
3. 注意肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤）的灭菌时间：115 ℃15分钟 。
六、涂抹检测：同于冰淇淋微生物检验方法，见124页。
七、空净检测：同于冰淇淋微生物检验方法，见125页。
八、水样检测：同于冰淇淋微生物检验方法，见126页。
硝酸盐还原实验 +
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