儿童肺炎支原体感染及耐药检测与分析

2020年10月14日发(作者：邹竞蒙)
儿童肺炎支原体感染及耐药检测与分析

? 儿童肺炎支原体感染及耐药检测与分析* ·论著· 儿童
肺炎支原体感染及耐药检测与分析* 刘调侠1 张晓瓒2 李
延琴1 (铜川市妇幼保健院 1.儿科；2.检验科， 陕西 铜川
727007) 【摘要】目的 分析肺炎患儿中肺炎支原体(MP)的
感染及耐药情况，并探 讨其临床特点及基因分型特征，为临
床合理选择抗生素提供理论依据。方法 收集2015年1月至2015年12月铜川市妇幼保健院儿科以发热、咳嗽等呼吸道
症状首诊确定MP感染的住院患儿1 20例。通过肺炎支原体
抗体检测、体外培养及核酸检测了解肺炎支原体感染状况，
测定多种抗 菌药物的最低抑菌浓度(MIC值),分离出耐药菌株。
根据药敏试验鉴定结果分为耐药组(n=98) 和非耐药组(n=22)，
比较耐药组与非耐药组患儿临床特征；将耐药组98例患儿
依据初选 抗生素种类分为初选阿奇霉素或红霉素组(n=78)和
初选头孢或青霉素类(n=20)，比较两组患 儿的临床特点。将
耐药菌株的23SrRNA基因序列与标准珠相比对，研究耐药
菌株的23S rRNA基因突变位点。结果 120例经临床诊断为
MP肺炎的患儿中，98例体外药敏试验结果提示 为耐药支原
体肺炎，对大环内酯类药物高度耐药。耐药组发热时间、住
院时间及给予大环内酯类 药物(阿奇霉素)后发热时间均较非
耐药组长(PP>0.05)。耐药组与非耐药组之间预后比较差异
有统计学意义(PP 【关键词】肺炎支原体； 感染； 儿童；
耐药机制 肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是患
儿急性上、下呼吸道感染的常 见病原体之一。研究表明，肺
炎支原体肺炎具有年龄分布特征和季节性，不同国家和地区
的发病 率差别较大。儿童MP感染主要以大环内酯类药物治
疗为主；近年来关于MP耐药现象的报道较多[1] 。本研究通
过对铜川地区住院肺炎患儿肺炎支原体感染及耐药检测与
分析，以期对临床MP肺炎 的诊治提供依据。 1 资料与方
法 1.1 一般资料 收集本院2015年1月至2015年12月 以
发热、咳嗽等呼吸道症状首诊确定MP感染的住院患儿120
例，其中男性患儿64例(53 .33%)，女性患儿56例(46.67%)。
MP肺炎诊断标准依据《诸福棠实用儿科学》第7版诊 断标
准，有发热、持续剧烈咳嗽、肺部啰音等呼吸道症状及体征，
伴胸部影像学单侧或双侧异常 改变，酶联免疫吸附法(ELISA)
检测肺炎支原体抗原阳性，青霉素或头孢类抗生素治疗无效，病程初期未发现其他病原感染的证据。排除标准：①体液和
细胞免疫异常。②正在接受免疫抑制剂治 疗。③既往患支气
管哮喘、反复呼吸道感染、先天性或继发性免疫抑制或缺陷、
肾脏或肝脏疾病 、心血管疾病及结缔组织疾病等，既往1个
月内接受住院治疗。④既往有重症肺炎病史仍未痊愈。⑤病< br>历资料不完整。纳入本研究的病例均已获患儿家属知情同意。
依据是否耐药分为耐药组(n=98 )和非耐药组(n=22)；依据98
例耐药支原体肺炎按初选抗生素种类分为初选阿奇霉素或
红霉素组(n=78)及初选头孢或青霉素类抗生素组(n=20)。
1.2 方法 1.2.1 主要仪器及试剂 TGL-16G型台式高速离心
机、Bio-rad公司Opticon 2 PCR扩增仪、GeneAmp PCR
System9600、HB-100型电热恒温水槽、ELX-800酶标仪、
Milli- Q纯水系统、DNP-9052型电热恒温培养箱、PCR扩增
试剂、MP- IgM检测试剂盒、DNA提取试剂盒、MP快速液
体培养基、MP标准株MP-129。 1.2.2 标本采集 所有患儿
在入院后24 h内完成标本的采集,抽取外周血2 ml用于
ELISA法检MP- IgM抗体，用无菌生理盐水浸湿的无菌咽拭
子适度用力刮拭患儿咽后壁,标记后行MP培养和MP- PCR
检测。 1.2.3 检测方法 ①酶联免疫吸附法试验(ELISA)检测
MP-Ig M抗体:按照深圳博卡生物有限公司提供的试剂盒说明
书进行操作及结果的判定。②MP快速液体培养法 ：液体培
养基在使用前置于4 ℃保存,用时移至室温待培养基融化后
使用。应注意MP对热和 干燥敏感,取材后应立即接种,若置
于转运培养基中,4 ℃能保存72 h。 所有患儿采取标本前用
温水漱口,然后用无菌生理盐水浸湿的咽拭子在患儿口腔咽
后壁捻转数次,60 min内送至 实验室,小心取出棉拭子,置于含
培养基的小瓶中,揽动棉拭子数次,再把棉拭子对着瓶壁,尽量
挤压出其中液体,取出棉拭子弃至医疗垃圾桶中。盖上瓶塞,
置37 ℃恒温箱中培养24～48 h 即可观察结果，待培养基颜
色由红转黄且无明显沉淀物时，判断为肺炎支原体培养阳性。
利用九 种抗生素的高低浓度在体外对微生物生长的抑制作
用,对微生物作耐药性进行分析,采用珠海市银科医学 工程股
份有限公司生产的MP 培养药敏试剂盒，严格按说明书进行
操作。③肺炎支原体PCR 检测：向咽拭子中加入4倍体积
的生理盐水，用1 ml移液器反复吹打后置4 ℃冰箱。用移
液器混匀后吸取1～1.5 ml离心管中。12 000 rpm离心5 min
后弃上清；在沉淀中加入50 μL的DNA提取液充分混均。
100 ℃恒温处理10 min;12 000 rpm离心5min后保存于-20 ℃
冰箱中备用。2×缓冲液10.0 μL，10.0 μmolL 的引物 P3 1.0
μL，10.0 μmolL 引物 P4 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O
7.0 μL。反应条件及循环：93 ℃变性2 min；95 ℃ 1 min，
50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；75 ℃延伸5 min。
荧光测定PCR产物采用胶回收试剂盒回收，采用T Easy载
体连接体系克隆，4 ℃连接过夜。转化感受态细胞，蓝白斑
筛选。采用Blast 功能进行序列分析，挑选测序结果一致的
克隆提取质粒备用。巢式PCR：2×缓冲液10.0 μL，40×Assay
Mix(含P3，P4，T3和T4各0.5 μL)，DNA模板1.0 μL，
ddH2O 7.0 μL，总体积20.0 μL。反应条件及循环：95 ℃ 1
min，92 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，40个循环。收集扩增前，
扩增时，扩增后荧光信号，采用SDS 软件获得标准曲线。
④肺炎支原体核糖体23s全序列分析：利用外引物
MN23SDVF、MN23SDVR和巢式引物 MN23SF1812、
MN23SR2152进行扩增,PCR产物采用双向测序。测得序列
与NCBI已登录的MP标准珠MP129 23SrRNA基因相比对。
产物由华大基因科技有限公司 进行测序。采用DNAstar软件
与肺炎支原体M129(GenBank Accession No．X68422)进行
序列比对分析。 1.3 观察指标 1.3.1 记录患儿的一般临床
资料 性别、年龄、住院天数、发热时间、呼吸道症状持续
时间、初起选择 抗生素的种类、病程中更换为大环内酯类抗
生素的时间，使用大环内酯类抗生素后发热时间、大环内酯< br>类抗生素的使用时间等。 1.3.2 记录相关辅助检查结果 白
细胞总数、中性粒细胞比例、 C反应蛋白、血沉、肺炎支原
体抗体结果、咽拭子肺炎支原体PCR结果、肺炎支原体培
养结果 及MIC值等，胸部影像学表现及影像学指标好转时间。
1.3.3 疗效判断 疗效分痊愈，显效， 进步，无效4级。痊愈:
初始治疗2周内体温、呼吸道症状及体征正常,实验室检查血
象、CR P均恢复正常;显效:体温呈下降趋势,但呼吸道症状、
体征，实验室检查均未完全恢复正常;进步:体 温不退,但呼吸
道症状、体征、实验室检查中至少有一项改善;无效:体温不
降,呼吸道症状体 征、实验室检查无改善,或一度改善又恶化。
1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件 进行数据处理。
计数资料采用2检验，计量资料用t检验，组间比较采用独
立样本t检验，非正 态分布资料采用非参数检验。P 2 结果
2.1 一般资料 120例经临床诊断为MP肺炎的患儿中，血清
MP-IgM抗体检测均为阳性。113例咽拭子肺炎支 原体PCR
检测阳性；其余7例PCR检测阴性，PCR检测阴性者咽分
泌物支原体培养阳性。 咽分泌物支原体培养阳性者为101例。
98例体外药敏试验结果提示为耐药支原体肺炎，对大环内酯< br>类药物高度耐药。体外药敏实验结果见表1。 表1 120例
MP肺炎患儿感染样本的药敏试验结果(MIC值，mgL)Table
1 Drug sensitivity test in children with MP pneumonia
samples菌株红霉素阿奇霉素克拉霉素四环素左氧氟沙星环
丙沙星 加替沙星莫西沙星米诺环素耐药株 64～25616～
25664～2560.125～0.50.2 5～0.50.5～1.00.032～
0.0640.016～0.0640.0125～0.5非耐 药株
0.0040.0040.0040.250.250.50.0320.0320.06 2.2 MP肺炎
耐药组与非耐药组临床特点比较 两组患儿的临床表现及检
验结果显示，耐药组发热时 间、住院时间及给予大环内酯类
药物(阿奇霉素)后发热时间均较非耐药组长(PP>0.05)，见表
2。 2.3 初选阿奇霉素或红霉素组和初选头孢或青霉素类抗
生素组临床特点比较 初选头 孢或青霉素类抗生素组20例，
治疗中更改为大环内酯类抗生素药物的平均时间为病程第
(5. 2±1.8) d。两组比较后发现在呼吸道症状持续时间、使用
大环内酯类抗生素后发热时间、白细胞 计数等指标差异有统
计学意义(P 表2 支原体肺炎耐药组与非耐药组临床特点比
较±s) Table 2 Clinical features of resistant group and
non-resistant group 临床指标 耐药组(n=98)非耐药组
(n=2 2)P年龄(岁)8±37±40.518发热时间(d)11±48±50.007
呼吸道症状时间< br>(d)18±516±40.085WBC(×109L)7±48±40.176中性粒细胞
比 例
0.68±0.740.61±0.830.457CRP(mgL)11.01±18.2313. 0±20
.610.972ESR(mmh)25±1322±140.682胸部影像所见好转
时间(d)14±313±50.661住院时间(d)12±38±40.001ML总疗
程10± 39±50.438用ML后发热时间(d)8±36±40.042 2.4 耐
药组与非耐药组患儿预后比较 耐药组与非耐药组之间预后
的比较有统计学意义(PP 表3 初选不同抗生素治疗的耐药
支原体肺炎患儿的临床特点±s) Table 3 Clinical
characteristics of children with different antibiotics
resistance of mycoplasma pneumonia primaries 临床指标
初选抗生素为阿奇霉素或红霉素(n=78)初选抗生素为青霉素
类或头孢类(n=20)P年龄(岁)8±28±50.237发热时间
(d)10±611±60. 681呼吸道症状时间
(d)19±517±40.046WBC(×109L)6±411±60.0 00中性粒细胞
比例
0.65±0.750.71±0.810.262CRP(mgL)10 .98±16.2311.51±2
0.610.074ESR(mmh)26±1323±140.9 22胸部影像所见好转
时间(d)14±314±40.939住院时间(d)13±311±40.1 59ML总
疗程10±310±50.249用ML后发热时间(d)9±35±40.009 表
4 耐药组与非耐药组患儿预后比较 Table 4 prognosis of
resistance group and non-resistant group 预后耐药组
(n=98)非耐药组(n=22)P痊愈30(30.61)14(63.64)①0.027显效39(39.79)6(27.28)进步20(20.41)1(4.54)无效
9(9.19 )1(4.54) 注：与耐药组比较，P 2.5 肺炎支原体核糖
体23S rRNA全序列分析 约90%耐药MP株发生了2063
位A→G(A2063G)的突变，少数MP耐药株发生了
A2064G(约5%)、A2063C、C2617GA 的突变，而且
A2063GC和 A2064G 的突变能引起 MP 对红霉素产生
高水平耐药，并对其他大环内酯类发生交叉耐药。 3 讨论
肺炎支原体(MP)是介于细菌与病毒之间,无细胞壁的一类原
核细胞型生物，其已 成为儿童社区获得性肺炎的常见病原体
之一。因为缺乏细胞壁结构,对β-内酞胺类、糖肽类和磺胺类< br>等抗生素固有耐药[2]。既往认为肺炎支原体对大环内酯类药
物敏感性高，无耐药性产生。20 00年Okazaki等[3]首次在
儿童患者体内分离到对大环内酯类抗生素耐药的MP。随后
国内外相继报道了在临床标本中尤其儿童患者中分离得到
对大环内酯类抗生素耐药的MP[4-7]。 德国报道MP的耐药
率为3%[8]；我国北京地区报道儿童MP的耐药率>80%[9]。
本 研究中支原体肺炎患儿耐药率为81.67%(98120),可见本
地区支原体耐药现象亦十分严重。 引起微生物对大环内酯
类抗生素耐药的主要机制是:①靶位改变: 基因突变或甲基
化。②主动 外排。③药物灭活。基因点突变导致的靶点改变
是肺炎支原体对大环内酯类耐药的最重要原因。23S rRNA
结构域V区和II区与抗生素直接结合的碱基点突变可导致抗
生素与核糖体亲和力下 降而引起耐药[10-15]。既往文献报道
的基因突变集中在23SrRNA V区2063或206 4位点基因颠
换或转换,主要表现为A2063G、A2063C和A2064G发生点
突变, 以A2063G最为常见[16-18]。本研究中约90%耐药MP
株发生了2063位A→G(A2 063G)的突变，少数MP耐药株
发生了 A2064G(约5%)、A2063C、C2617GA 的突变，而
且A2063GC和 A2064G 的突变能引起 MP 对红霉素产
生高水平耐药，并对其他大环内酯类发生交叉耐药。可见核
糖体23S rRNA A2063G核苷酸点突变仍是引起肺炎支原体
对红霉素耐药的主要机制。 本研究显示耐药组发热时间 和
给予大环内酯类药物(阿奇霉素)后发热时间均较非耐药组长，
提示耐药组患儿病情相对更严 重，发热时间更长。两组间年
龄、呼吸道症状时间、白细胞计数、中性粒细胞比例、C反
应蛋白 、血沉、影像所见好转时间、大环内酯类药物总疗程
等方面比较并无差异。耐药组住院时间明显延长，考 虑与耐
药组患者病程中发热时间及使用大环内酯类药物后发热时
间均较非耐药组患儿延长有关。 在病程初期，在白细胞计
数较正常升高的病例治疗上，医生往往更易选择头孢或青霉
素类抗生素 ，因此大环内酯类药物的初始给药时间较晚。初
选头孢及青霉素类药物组，比初选大环内酯类抗生素的患 儿
用大环内酯类药物后发热时间较短，差异有统计学意义，提
示初选头孢及青霉素类药物对耐药 支原体肺炎患儿的发热
程度影响并不明显。病程初期使用非有效抗生素(头孢或青霉
素类)者住 院时间无明显延长，提示其对治疗效果的影响不明
显。本研究提示非耐药组患儿预后好于耐药组，而耐药 组治
疗无效病例高于耐药组，但并无统计学意义，此部分病例为
重症耐药支原体肺炎，其研究还 有待于进一步完善。目前支
原体肺炎耐药率较高，对于是否可继续使用大环内酯类抗生
素治疗仍 有争议[19]。目前国内外治疗选择仍以阿奇霉素和
红霉素为主，必要时予肾上腺皮质激素等免疫治疗 。 在耐
药支原体感染十分严重的现状下，支原体肺炎治疗过程中应
尽早使用不同的诊断方法， 及时判断病情程度，以减轻患儿
组织器官的损害，缩短病程，尽量避免肺内外并发症的发生
[2 0]。MP快速鉴定培养与直接药敏试验方法标本获取容易，
检测技术操作简单，检测结果可为临床诊疗 提供科学依据。
针对耐药支原体感染的病原学和发病机制以及有效的治疗
仍有待于进一步研究。 4 结论 铜川地区2015年支原体肺
炎患儿对大环内酯类抗生素耐药现象严重，其耐药机制主要与2063位A→G(A2063G)的点突变有关。非耐药组患儿预
后好于耐药组。MP快速鉴定 培养与直接药敏试验方法标本
获取容易，检测技术操作简单，检测结果可为临床诊疗提供
科学依 据，应在临床推广应用。 【参考文献】 [1]Zhao F, Liu
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(收稿： 2016-05-16； 修回： 2016-08-08； 编辑： 张文
秀) The infection of mycoplasma pneumoniae, detection
and analysis of drug resistance in children LIU Diaoxia1,
ZHANG Xiaozan2, LI Yanqin1 (ment of Pediatrics,
Tongchuan Maternal and Child Health Care Center,
Tongchuan 727007, Shanxi, China;2. Clinical Laboratory,
Tongchuan Maternal and Child Health Care Center,
Tongchuan 727007, Shanxi, China) 【Abstract】Objective
To analyze the infection and drug resistance of
mycoplasma pneumoniae in children, explore its clinical
characteristics and genotyping feature, and provide a
theoretical basis for the selection of antibiotic. Methods
120 children of mycoplasma pneumoniae pneumonia were
enrolled. The infection of mycoplasma pneumoniae was
explored by detection of mycoplasma pneumoniae
antibody and nucleic acid. The MIC value of multiple
antimicrobial drugs was tested. The drug-resistant strains
was isolated. The children were divided into drug
resistance group and non- drug resistance group by
drug- resistant results. The clinical features drug resistance
group and non- drug resistance group were compared.
The gene sequence of 23SrRNA of drug-resistant strains
and non- drug resistance group were s 98
cases were drug-resistant pneumonia according to
susceptibility test results in vitro, which were highly
resistant to macrolides .The time of fever and
hospitalization in drug resistance group were longer than
that of non- drug resistance group (PP 【Key words】
Mycoplasma pneumoniae； Infection； Children；
Mechanism of drug resistance 基金项目：陕西省科技攻关
课题(CX14A016) 【中图分类号】R 735+.2；R 725.6 【文
献标志码】A doi：.1672-3511.2016.11.031