牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研究进展091108

2020年10月10日发(作者：那彦成)
我国牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研究进展
摘要：本文对牛轮状病毒的分离鉴定和疫苗研制这两方面的研究进展做一综述。
关键词：牛轮状病毒；犊牛腹泻；分离鉴定；疫苗；
牛轮状病毒（Bovine Rotav irus，BRV）是引起牛传染性腹泻疾病的重要病原之一。自然
条件下，不同品种、不同年龄的牛都 均具感染性，但以犊牛主发。据报道，目前国内外发现
的BRV均为A组或G5、G6、G8、和G10 血清型。迄今国内已检测到的BRV均属于G6、
G10血清型的，对BRV的研究多集中在毒株的检测 和疫苗的研制方面，本文就此做以综述。
1、 分离鉴定
1.1分离方法
自19 69年Mebus等
[1]
在电镜下观察到BRV并成功分离毒株以来，各国有关BRV分离< br>方法的研究报告不断出现。我国在这方面的研究报道始于1984年，吴城等
[2]
从 福建某县采
集了25份患有BRV腹泻疾病的牛粪便，经处理接种于牛肾原代细胞，传代后细胞始终未出
现典型病变。而次年刘纯荣等
[3]
应用MA-104细胞由耗牛病料分离出了4株轮 状病毒。李昌
仁等
[4]
1987年同样使用MA-104细胞成功的从黑龙江省腹泻 犊牛粪便中分离出了4株BRV，
命名为DNRV
1
、DNRV
2
、 DNRV
3
、DNRV
4
。孙继国等
[5]
1996年对B RV NCDV株在MA-104、
LLc- mk2和Hela三种细胞中的生长情况进行了比较研究，结果是在MA-104细胞上生长最
好， HeLa细胞上不生长，在LLc-mk2细胞上虽然能生长，但无细胞病变。苏小康等
[6]
2005
年应用Marc145细胞成功分离出了一株BRV。目前分离BRV所使用的细胞首选为MA -104
细胞。它能够给BRV提供一个很好的增殖环境。
1.2鉴定方法
有关毒 株的鉴定方法种类繁多，根据其各自的优缺点应用在不同的情况下。通常为了对
分离株进行充分、系统的 鉴定会同时采用一种以上的方法。现将常用、可靠的鉴定方法简介
如下。
1.2.1 电镜法
在BRV的检测中常用的电镜方法有直接电镜和免疫电镜两种。直接电镜法操作简单、
结果可靠 ，但检出率受病毒粒子数量、完整性的影响，因此往往结合其他方法一同使用。免
疫电镜比直接电镜敏感 性更高，更易观察，检出率是直接电镜的10倍以上，并可同时检出
不同的血清型。我国李决等
[7]
人1987年应用电子显微镜技术、PAGE和ELISA等方法，首
次在河南的腹泻犊 牛粪便中检测出了轮状病毒。后来又有关平原等
[8]
应用直接电镜和免疫电
镜方法对 腹泻犊牛的粪便、肠内容物进行检测，结果在两种病料中均见BRV粒子。证实了
电镜方法用作BRV腹 泻诊断是可行的。近年栾婧婧等
[9]
从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一
株BRV，应 用电镜技术较为系统的观察了病毒在宿主细胞中的形态结构变化和宿主的结构
变化,丰富了BRV的鉴定 依据。因电子显微镜具有极高的放大倍数，可使病毒粒子的形态结
构清晰可见的特点，使其至今仍广泛应 用在BRV的检测中。但电镜检测所需成本较高，不
适于大量样品的检测。
1.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
PAGE可将BRV RNA的11条带清晰的 呈现在电泳图上，根据这11条带的分布进行A~G
的分组，同时反映了病毒RNA基因组的差异和变异 ，现已检测到的BRV均为A组，其电
泳条带呈4：2：3：2的特征分布。倪亚伟
[10]< br>1986年采用PAGE的方法对已分离出的四株
BRV进行鉴定，结果电泳图谱呈现出BRV典 型的11条带，进一步分析发现分离株BRV
6576
和BRV
6555
的第 7、8、9三条带之间的距离具有明显差异。这为分子流行病学的调查提供了
依据。付新成等
[ 11]
2009年从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪便样品中提取病毒RNA， PAGE检测
结果是 6个样品中有4个样品的电泳条带呈现A组BRV特有的4∶2∶3∶2分布。由此证
明该牛群存在A组 BRV感染。PAGE作为BRV鉴定方法之一，具有特异性强，操作、设备
简单等优点，但病毒的RN A易降解导致假阴性的结果出现。
1.2.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）
早在19 83年世界卫生组织已将ELISA列为诊断轮状病毒的标准方法。在我国有关这方
面的报道最早见于1 985年刘纯荣等
[12]
应用ELISA、ELISA阻断试验、免疫电镜、PAGE和细胞培养等方法对四川省耗牛进行检测。证实了BRV是四川耗牛腹泻的主要病原。类似的
报道还有 李决等
[7]
人和林雪等
[13]
人先后对河南地区犊牛粪便样品的 检测时应用到了此
方法。梅魁敏等人
[14]
应用该方法在江西省养牛业中检测到BR V的存在。2009年曹竹婷等
[15]
确定了间接ELISA检测牛血清中BRV抗体的最佳 工作条件及判定标准，实验表明该方法具
有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等特点，适合于对BRV 特异性抗体的动态监测和批
量检测。ELISA不仅适用于临床标本的抗原、抗体的检测，也适合于进行 大规模样品的检测，
开展流行病学调查。除具有灵敏、特异、简单、快速、稳定等特点还易于自动化操作 。
1.2.4 RT-PCR
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合 酶链式反应（PCR）相结合的技术。
近年来国内外多采用该方法鉴定未知毒株。敏感性可达到1pg水 平，有很强的特异性和可重
复性。栾婧婧等
[16]
2006年建立了半巢式RT- PCR快速检测犊牛轮状病毒的方法，该方法设
计了针对BRV VP7基因和BRV G6血清型的两 种特异性引物，根据特异性扩增结果鉴定毒
株。实验结果表明该方法具有较好特异性、敏感性。在快速诊 断BRV腹泻疾病的同时又鉴
定了该病毒属于G6血清型的。常继涛等
[17]
200 8年采集了内蒙古、黑龙江、新疆、北京、
安徽等地犊牛腹泻粪便样品，对其中11份PAGE检测阳性 者，采用半巢氏多重PCR的方法
进行了G血清型的鉴定。结果是其中4份为国内已有的G6血清型，另 外7份为国内从未检
测到的G10血清型。将这11份样品接种到MA104细胞上，最终仅分离到一株 病毒，采用
半巢氏多重PCR的方法对其进行G、P血清型的鉴定，结果是该分离株血清型为G10P[ 11]
的，命名为HM26。
鉴于目前BRV与其他致牛腹泻病原体的混合感染, 我国学者 建立了能同时检出多种牛
腹泻病原体的方法。如张俭伟等
[18]
在2008年建立了 能够同时检测牛轮状病毒(BRV)与牛病
毒性腹泻病毒(BVDV)的双重RT-PCR方法，降低了 检测成本和检测时间。次年柳强等
[19]
根
据GenBank中牛冠状病毒（BCV ）、BRV核苷酸序列，分别设计并合成了两对特异性扩增
BCV、BRV的引物，优化了PCR反应条 件，最终建立了可以同时检测这两种病原的双重
RT- PCR方法。随后，在对多种病毒进行扩增时仅有BCV、BRV出现大小分别为244 bp和
382 bp的特异性条带，表现出极高的特异性。另外对BCV和BRV检测的敏感度分别为1个
和100个T CID
50
100μL。
1.2.5 核苷酸序列测定
核酸序列测定是
指是通过化学方法测定 DNA 片段中的核苷酸排列顺序的技术，是
在高分
辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上建立起来的，可分辨出不同序列之间仅一个碱基的差
别，适合于同源序列之间的分析比较。近年国内外开始将其应用到BRV的鉴定中。我国应
用此项技术 检测BRV的报道较少。栾婧婧等
[20]
2006年从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一毒株，通过RT-PCR扩增该毒株的保护性抗原VP7基因，扩增产物连接到载体后进行序列测
定， 在Genebank中进行同源性检索,发现该序列与RF株和轮状病毒标准株NCDV的同源性
分别为 98.9%和98.3%。与已发表的G6血清型轮状病毒的VP7基因序列的同源性在
84.7%~9 9.06%之间。由此可见,该分离毒株为G6血清型BRV。次年姜向阳等
[21]
从疑似轮 状
病毒腹泻犊牛粪样中分离到一株牛轮状病毒。通过RT-PCR的方法扩增VP1基因，连入载
体并测序，经DNAStar软件分析,可知分离株的VP1基因与RF株和UK株的核苷酸同源性
分 别为98.9%和95%,证明分离毒株是一株牛轮状病毒。
2 疫苗的研究
BRV腹泻同其他病毒性疾病一样 ,均无特效疗法 。因此，接种疫苗是预防本病的最佳
方法 。早在1973年美国农业部批准了第一个新生犊牛轮状病毒口服减毒疫苗用于免疫预防，
时至今日，本 病疫苗的研制仍为人们探讨和研究。 现就我国疫苗的研究现状介绍如下。
2.1 弱毒活疫苗
弱毒活疫苗系利用人工致弱或天然弱毒的毒株制成的疫苗。这类疫苗的特点是用量少、
免疫力产生快且坚强；由于制苗之种毒为活毒，接种后可于体内增殖，故存在变异——毒力
变强，即“返 祖”的危险；同时也存在免疫机体排毒可能。因此，在弱毒活疫苗的研制中需
要对其安全性倍加关注。
1993年我国的林继煌等
[22]
人用BRV014株的高代细胞培养物对产前3 个月和1个月的
黄牛进行两次免疫，每次肌注10ml，同时设立对照。利用反向间接血凝抑制(RIH I)试验测定
受试牛的血清和初乳之BRV抗体的变化，检测结果是二者滴度均为免疫组高于对照组，且
差异显著。抗体持续期免疫组为13天，而对照组仅有5天。本研究还对所产犊牛的腹泻发
生率 进行了统计，结果是免疫组腹泻发生率只有10.8%，而照组则高达57.1%；在病情和病
程表现上 也是前者较后者轻微，短暂。该研究为我国的BRV弱毒活疫苗的研制首开先河，
为后续弱毒活疫苗的研 制提供了参考。但此项工作未测接种疫苗的病毒滴度和病毒的排出
率，因此做为疫苗的安全问题留有悬笔 。
何孔旺等
[23]
1998年同样用BRV014株的高代次(50代以上)细胞 培养物(TCID
50
=10
-6.5
)于
孕牛产前3个月和1个月 各免疫1次，每次肌注8~10ml，同时设立对照。利用RIHI试验测
定受试牛的初乳中BRV抗体 的变化,检测结果是免疫组初乳中抗体滴度最高可达1：4096，
直到产后20 d抗体滴度仍能维持 在1∶64，这与对照组有显著差异。抗体持续期免疫组为
16天，而对照组仅有3天。此外对所产犊牛 腹泻发生率的统计显示，免疫组所产犊牛的腹
泻发生率较对照组降低83.8%。以上研究为BRV弱毒 活疫苗的研制提供了候选毒株。
基于我国BRV主要流行的血清型有G6、G10两种，因此研制多价 （二价）疫苗更具应
用价值。常继涛等
[24]
2009年借鉴人轮状病毒的研究平台 ，以羊轮状病毒LLR-85株（G10）
和BRV NCDV株（G6）为亲本，构建出一株具有G6 血清型的，对牛天然弱毒的基因重配
株，并命名为R191，以R191株和LLR-85株制成的二价 减毒疫苗涵盖了我国BRV主要流
行的血清型。经田间试验表明该疫苗具有良好的免疫原性和较低的病毒 释放率。为BRV多
价弱毒活疫苗的研制提供了参考。BRV RNA分11节段，便于通过生物技术手 段获得基因重
配株。将来随着新血清型的出现，运用该方法可以很容易制得包含新血清型的多价弱毒活疫
苗，实现对BRV腹泻疾病及时、全面的预防。

2.2 灭活疫苗
灭活 疫苗系选用标准强毒株或免疫原性特别好的弱毒株，经人工培养，用化学或物理方
法杀死（灭活）后制成 ，至今常用的灭活方法是用甲醛等化学试剂灭活。这类疫苗较弱毒活
疫苗安全性高，但免疫原性差，使用 时一般要加佐剂以提高其免疫原性。我国有关BRV灭
活疫苗的研究开展较晚，报道较少。
张俭伟等
[25]
2007年将BRV CHLY 株（TCID
50
=10
-6.59
）按常规方法制成油乳佐剂灭活疫
苗。对产前2个月和1个月的荷 斯坦牛进行两次免疫，每次3ml，同时设立对照。用间接
ELISA、中和试验测定受试牛之乳清和所 产犊牛血清中BRV抗体的变化。检测结果是免疫
组母牛乳清及其所产犊牛血清中BRV抗体效价分别在 第1天和第2天达到了最大值，而对
照组其效价一直处于较低水平，两组差异极显著。本研究还进行了攻 毒实验，结果是免疫组
所产犊牛的发病率较对照组所产犊牛低，潜伏期也是前者长于后者。证实了该疫苗 对犊牛腹
泻有保护作用。此研究为灭活疫苗的研制奠定了理论基础。
[26]
次年又以 同一毒株，按常规
方法制备油乳佐剂疫苗和铝佐剂疫苗，比较不同佐剂疫苗的免疫原性。结果是两种疫苗 均具
有良好的免疫原性。
同年曹竹婷等
[27]
做了类似的研究，结果是免 疫组动物免疫后30天内没有因注射该疫苗
而产生副作用，证实了该疫苗的安全性。免疫组犊牛血清和牛 初乳中特异性抗体较对照组有
显著提高，证实了该疫苗具有很好的免疫原性。
3 结束语 < br>BRV的危害一直未能根除，而且愈演愈烈，影响了养牛业的发展，因此，人们一直以
来不断对他 进行研究，除本文所提到的分离鉴定和疫苗的研究外还有许多方面也在积极的研
究中，例如：单克隆抗体 的制备、流行病学和结构功能等的研究。
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